Die Prävalenz von Extend-Spectrum β-Lactamase (ESBL) produzierenden Isolaten unter gewöhnlichen Enterobacteriaceae in Taiwan

Materialen und Methoden

1. Sammlung von Bakterienisolaten

   Die Mitarbeiter des National Health Research Institute haben seit 1998 eine Langzeitüberwachung der Antibiotikaresistenz in 22 bis 44 Krankenhäusern eingerichtet, die in allen Teilen der Taiwan-Taiwan Surveillance of Antimicrobial Resistance (TSAR) verteilt sind. Es wurde fünf Mal in den Jahren 1998, 2000, 2002, 2004 und 2006 durchgeführt und wurde als TSAR-I, TSAR-II, TSAR-III, TSAR-IV und TSAR-V ​​bezeichnet. In dieser Studie werden Isolate von Enterobacteriaceas aus TSAR-IV rekrutiert. Jeweils 50 Isolate von Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens und Morganella morganii werden für die folgenden mikrobiologischen Studien aufgenommen (etwa 10 % der von TSAR IV gesammelten Isolate).

   Isolate werden durch Screening-Tests in ESBL-produzierende oder nicht-produzierende Gruppen eingeteilt. Alle verfügbaren Isolate wurden mit konventionellen Methoden bis auf Art- bzw. Gattungsebene identifiziert. Isolate mit derselben Spezies, die von demselben Patienten gewonnen wurden, gelten als ein Isolat. Die Isolate wurden alle bei -70 °C in Trypticase-Sojabrühe (Difco Laboratories, Detroit, MI), ergänzt mit 15 % Glycerin, gelagert, bevor sie getestet wurden.

2. Datensammlung

   Zu den für jedes Isolat gesammelten Informationen gehörten: Sammeldatum, Testdatum, Identifikation, Infektionsort, Krankenhausstation des Patienten und ob das Isolat in der Gemeinde erworben wurde (d. h. Probe, die <48 Stunden nach der Aufnahme erhalten wurde), Dauer des Patienten Krankenhausaufenthalt. Die Empfindlichkeit aller isolierten gegen zielgerichtete antimikrobielle Mittel wird durch ihre minimale Hemmkonzentration (MHK-Werte) bestimmt, die den CLSI-Grenzwerten für das jeweilige antimikrobielle Mittel folgt.

3. Antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung

   • Vorbereitung des Inokulums Sterile Kochsalzlösung (0,85 % NaCl), geeigneter Puffer oder Brühe für die Vorbereitung des Inokulums, je nach Organismus. Das CLSI-Inokulumverfahren für Aerobier und andere Mikroorganismen sollte angewendet werden. 0,5 McFarland-Trübung wird als Standard für Aerobier verwendet.
   • Inokulation Verwenden Sie sterile Ösen/Tupfer, um die optimale Menge an Inokulumsuspension zu erhalten. Die gesamte Agaroberfläche dreimal abtupfen; Drehen Sie die Platte jedes Mal um etwa 90 Grad, um eine gleichmäßige Verteilung der Inokulums zu gewährleisten. Lassen Sie überschüssige Feuchtigkeit ca. 10-15 Minuten aufnehmen, damit die Oberfläche vollständig trocken ist, bevor Sie die E-Teststreifen auftragen.
   • Aufbringen der E-Teststreifen Stellen Sie sicher, dass die beimpfte Agaroberfläche vollständig trocken ist, bevor Sie die E-Teststreifen auftragen. Verwenden Sie einen Etest-Applikator oder eine Pinzette, um den Griff des Streifens (mit E gekennzeichnet) zu greifen und auf die beimpfte Agaroberfläche zu legen, wobei sicherzustellen ist, dass die MHK-Skala nach oben zeigt und das Konzentrationsmaximum am nächsten zum Rand des Streifens liegt Platte. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Streifen in vollständigem Kontakt mit der Agaroberfläche ist. Nach dem Auftragen kann der Streifen aufgrund der sofortigen Freisetzung des Antibiotikums in den Agar nicht bewegt werden. Es wird empfohlen, 4-6 verschiedene E-Teststreifen auf eine 150-m-Agarplatte aufzubringen. In dieser Studie werden zusätzlich zu Ertapenem die E-Teststreifen von sechs antimikrobiellen Wirkstoffen angewendet, darunter Cefepim, Cefepim plus Clavulansäure (zur Identifizierung von ESBL-bildenden Isolaten), Ciprofloxacin, Cefmetazol, Amikacin, Tigecyclin.
   • Inkubation Die verwendete Inkubationstemperatur und -atmosphäre müssen für das Wachstum bestimmter Bakterienarten und des zu testenden Antibiotikums optimal sein. CLSI empfiehlt 35℃/16-18 Stunden/Umgebungsatmosphäre für nicht anspruchsvolle Aerobier und fakultative Anaerobier.
   • Ablesen der MHK Nach Ablauf der Inkubationszeit und wenn Bakterienwachstum deutlich sichtbar wird, lesen Sie den MHK-Wert am Schnittpunkt zwischen dem Rand der Hemmellipse und dem E-Teststreifen ab. Verwenden Sie den E-Test-Leseleitfaden und andere technische Leitfäden, um verschiedene Muster richtig zu lesen. Zum Nachweis wird ein Eteststreifen (AB Biodisk, Solna, Schweden) mit Cefepim (MHK-Testbereich 0,25–16 mg/l) und Cefepim (MHK-Testbereich 0,064–4 mg/l) plus 4 mg/l Clavulansäure verwendet die Expression von ESBL gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Verringerung der MIC um ≥3 zweifache Verdünnungen in Gegenwart von Clavulansäure ist ein Indikator für die ESBL-Produktion. Eine Verformung der Ellipsen oder das Vorhandensein einer "Phantom"-Zone ist auch ein Indikator für die ESBL-Produktion, selbst wenn das MIC-Verhältnis < 8 ist oder nicht gelesen werden kann.
   • Qualitätskontrolle Um das System hinsichtlich korrekter Handhabung, Qualität und Konsistenz von Materialien und Methoden zu überprüfen, testen Sie Qualitätskontrollstämme mit den betreffenden Antibiotika. S. pneumoniae und H. influenzae können durch Mikroverdünnung der Bouillon unter Umgebungsinkubation bestimmt werden. Die folgenden Organismen sind als Kontrollstämme enthalten: S. aureus ATCC 29213, E. faecalis ATCC 29212, S. pneumoniae ATCC 49619, E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218, K. pneumoniae ATCC 700603 und P. aeruginosa ATCC 27853. Für jeweils 500 durchgeführte E-Tests wird ein Kontrolltest mit den oben genannten 5 Kontrollstämmen durchgeführt.
   • Molekulare Studien Isolate mit Expression von ESBLs werden weiter typisiert unter Anwendung der gepulsten Feld-Gelelektrophorese (PFGE)-Methode. Die detaillierten Verfahren von PFGE und die Interpretationen von PFGE-Bandmustern entsprechen der Beschreibung in unserem vorherigen Bericht (13).

Datenanalyse

Isolate werden gemäß den vom CLSI bereitgestellten Richtlinien in anfällig, intermediär und resistent kategorisiert. Isolate, die gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen intermediär oder resistent sind, werden ebenfalls als nicht empfindlich gegenüber den Wirkstoffen eingestuft. Die Unempfindlichkeitsraten unter den wichtigsten bakteriellen Pathogenen werden nach den verschiedenen Infektionsorten und der Herkunft der Isolate analysiert. Die Assoziationen zwischen geografischem Gebiet, Krankenhaustypen, von denen diese Isolate bezogen wurden, gegen die antimikrobielle Empfindlichkeit werden analysiert.