La prevalencia de aislamientos productores de β-lactamasa de espectro extendido (BLEE) entre enterobacterias comunes en Taiwán

Materiales y métodos

1. Colección de aislados bacterianos

   El personal del Instituto Nacional de Investigación en Salud ha establecido una vigilancia a largo plazo de la resistencia a los antimicrobianos de 22 a 44 hospitales distribuidos en todas las partes de Taiwán-Taiwán Vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos (TSAR) desde 1998. Se ha realizado cinco veces en los años 1998, 2000, 2002, 2004 y 2006 y se denominaron TSAR-I, TSAR-II, TSAR-III, TSAR-IV y TSAR-V. En este estudio, se reclutarán aislados de Enterobacteriaceas de TSAR-IV. Cada 50 aislamientos de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens y Morganella morganii se inscribirán (alrededor del 10 % de los aislamientos recolectados por TSAR IV) para los siguientes estudios microbiológicos.

   Los aislados se dividirán en grupos productores o no productores de ESBL mediante pruebas de detección. Todos los aislamientos disponibles fueron identificados a nivel de especie o género mediante métodos convencionales. Los aislamientos con la misma especie recuperados del mismo paciente individual se consideran un solo aislamiento. Todos los aislados se almacenaron a -70 ℃ en caldo de soya tripticasa (Difco Laboratories, Detroit, MI) suplementado con 15 % de glicerol antes de ser analizados.

2. Recopilación de datos

   La información recolectada para cada aislado incluyó: fecha de recolección, fecha de prueba, identificación, sitio de infección, unidad hospitalaria del paciente y si el aislado fue adquirido en la comunidad (es decir, muestra obtenida <48 horas después de la admisión), la duración de la estancia en el hospital. La susceptibilidad de todos los aislados frente a los agentes antimicrobianos específicos estará determinada por su concentración mínima inhibitoria (valores MIC) siguiendo los puntos de corte CLSI para el agente antimicrobiano respectivo.

3. Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana

   • Preparación de inóculos Solución salina estéril (0,85% NaCl), tampón o caldo adecuado para la preparación de inóculos, según el organismo. Debe utilizarse el procedimiento de inóculos CLSI para aerobios y otros microorganismos. Se utilizará una turbidez de 0,5 McFarland como estándar para aerobios.
   • Inoculación Use asas/hisopos estériles para obtener la cantidad óptima de suspensión de inóculos. Limpie toda la superficie del agar tres veces; girando la placa aproximadamente 90 grados cada vez para asegurar una distribución uniforme de los inóculos. Permita que el exceso de humedad se absorba durante aproximadamente 10 a 15 minutos para que la superficie esté completamente seca antes de aplicar las tiras reactivas E.
   • Aplicación de las tiras reactivas E Asegúrese de que la superficie del agar inoculado esté completamente seca antes de aplicar las tiras reactivas E. Use un aplicador Etest o use unas pinzas para sujetar el mango de la tira (están etiquetados como E) y colóquelos sobre la superficie de agar inoculado, asegurándose de que la escala MIC esté hacia arriba y que la concentración máxima esté lo más cerca posible del borde de la tira. lámina. Asegúrese de que toda la tira esté en completo contacto con la superficie del agar. Una vez aplicada, la tira no se puede mover debido a la liberación instantánea de antibiótico en el agar. Se recomienda aplicar de 4 a 6 tiras reactivas E diferentes en una placa de agar de 150 m. En este estudio, se aplicarán las tiras reactivas E de seis agentes antimicrobianos, incluidos cefepima, cefepima más ácido clavulánico (para la identificación de aislados productores de BLEE), ciprofloxacina, cefmetazol, amikacina, tigeciclina, además de ertapenem.
   • Incubación La temperatura de incubación y la atmósfera utilizadas deben ser óptimas para el crecimiento de especies bacterianas particulares y el antibiótico que se está probando. CLSI recomienda 35 ℃/16-18 horas/atmósfera ambiente para aerobios no fastidiosos y anaerobios facultativos.
   • Lectura de la MIC Después de completar el período de incubación y cuando el crecimiento bacteriano sea claramente visible, lea el valor de la MIC en el punto de intersección entre el borde de la elipse de inhibición y la tira reactiva E. Use la Guía de lectura de la prueba E y otras guías técnicas para leer correctamente diferentes patrones. Se utilizará una tira Etest (AB Biodisk, Solna, Suecia) que contiene cefepima (rango de prueba MIC, 0,25-16 mg/L) y cefepima (rango de prueba MIC, 0,064-4 mg/L) más 4 mg/L de ácido clavulánico para detectar la expresión de ESBL de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reducción de MIC en ≥3 diluciones dobles en presencia de ácido clavulánico es un indicador de la producción de ESBL. La deformación de las elipses o la presencia de una zona "fantasma" también es un indicador de la producción de ESBL incluso si la relación MIC es <8 o no se puede leer.
   • Control de calidad Para verificar el sistema con respecto a la manipulación correcta, la calidad y la consistencia de los materiales y métodos, analice las cepas de control de calidad con los antibióticos correspondientes. S. pneumoniae y H. influenzae pueden determinarse por microdilución en caldo bajo incubación ambiental. Los siguientes organismos se incluyen como cepas de control: S. aureus ATCC 29213, E. faecalis ATCC 29212, S. pneumoniae ATCC 49619, E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218, K. pneumoniae ATCC 700603 y P. aeruginosa ATCC 27853. Por cada 500 pruebas E realizadas, se realizará una prueba de control que incluya las 5 cepas de control anteriores.
   • Estudios moleculares Los aislamientos con expresión de ESBL se tipificarán más utilizando el método de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE). Los procedimientos detallados de PFGE y las interpretaciones de los patrones de bandas de PFGE son como la descripción en nuestro informe anterior (13).

Análisis de los datos

Los aislamientos se clasifican en susceptibles, intermedios y resistentes de acuerdo con las pautas proporcionadas por el CLSI. Los aislamientos intermedios o resistentes a los agentes antimicrobianos también se clasifican como no sensibles a los agentes. Se analizarán las tasas de no susceptibilidad entre los principales patógenos bacterianos según los diferentes sitios de infección y origen de los aislamientos. Se analizarán las asociaciones entre área geográfica, tipos de hospitales de donde se obtuvieron estos aislamientos frente a la susceptibilidad antimicrobiana.