A prevalência de isolados produtores de β-lactamase de espectro estendido (ESBL) entre enterobactérias comuns em Taiwan

Materiais e métodos

1. Coleta de isolados bacterianos

   As equipes do Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde estabeleceram uma vigilância de longo prazo da resistência antimicrobiana de 22 a 44 hospitais distribuídos em todas as partes da Vigilância de Resistência Antimicrobiana de Taiwan-Taiwan (TSAR) desde 1998. Foi realizado cinco vezes no ano de 1998, 2000, 2002, 2004 e 2006 e foi nomeado como TSAR-I, TSAR-II, TSAR-III, TSAR-IV e TSAR-V. Neste estudo, serão recrutados isolados de Enterobacteriaceas de TSAR-IV. Cada 50 isolados de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens e Morganella morganii serão inscritos (cerca de 10% dos isolados TSAR IV coletados) para os estudos microbiológicos seguintes.

   Os isolados serão divididos em grupos produtores ou não produtores de ESBL por testes de triagem. Todos os isolados disponíveis foram identificados ao nível de espécie ou gênero por meio de métodos convencionais. Isolados com as mesmas espécies recuperados do mesmo paciente individual, são considerados um isolado. Os isolados foram todos armazenados a -70 ℃ em caldo de soja tripticase (Difco Laboratories, Detroit, MI) suplementado com 15% de glicerol antes de serem testados.

2. Coleção de dados

   As informações coletadas para cada isolado incluíram: data da coleta, data do teste, identificação, local da infecção, unidade hospitalar do paciente e se o isolado foi adquirido na comunidade (ou seja, amostra obtida <48 horas após a admissão), o tempo de internação do paciente Internação hospitalar. A suscetibilidade de todos os isolados contra agentes antimicrobianos direcionados será determinada por sua Concentração Inibitória Mínima (valores MIC) seguindo os pontos de corte CLSI para o respectivo agente antimicrobiano.

3. Teste de suscetibilidade antimicrobiana

   • Preparação de inóculos Soro fisiológico estéril (0,85% NaCl), tampão ou caldo adequado para preparação de inóculos, dependendo do organismo. O procedimento de inóculo do CLSI para aeróbios e outros microrganismos deve ser usado. A turbidez de 0,5 McFarland será usada como padrão para aeróbios.
   • Inoculação Use alças/swabs estéreis para obter a quantidade ideal de suspensão de inóculo. Esfregue toda a superfície do ágar três vezes; girando a placa aproximadamente 90 graus de cada vez para garantir uma distribuição uniforme de inóculos. Deixe o excesso de umidade ser absorvido por cerca de 10-15 minutos para que a superfície esteja completamente seca antes de aplicar as tiras de teste E.
   • Aplicação das tiras de teste E Certifique-se de que a superfície do ágar inoculado esteja completamente seca antes de aplicar as tiras de teste E. Use um aplicador Etest ou use uma pinça para segurar o cabo da tira (estão marcados com E) e coloque-os na superfície do ágar inoculado, certificando-se de que a escala MIC esteja voltada para cima e que a concentração máxima esteja mais próxima da borda do placa. Certifique-se de que toda a tira esteja em contato total com a superfície do ágar. Uma vez aplicada, a tira não pode ser movida devido à liberação instantânea de antibiótico no ágar. Recomenda-se aplicar 4-6 tiras de teste E diferentes em uma placa de ágar de 150 m. Neste estudo, as tiras de teste E de seis agentes antimicrobianos, incluindo cefepima, cefepima mais ácido clavulânico (para a identificação de isolados produtores de ESBL), ciprofloxacina, cefmetazol, amicacina, tigeciclina serão aplicadas além de ertapenem.
   • Incubação A temperatura e a atmosfera de incubação utilizadas devem ser ideais para o crescimento de determinadas espécies bacterianas e do antibiótico a ser testado. O CLSI recomenda 35℃/16-18 horas/atmosfera ambiente para aeróbios não exigentes e anaeróbios facultativos.
   • Leitura da MIC Após completar o período de incubação e quando o crescimento bacteriano se tornar nitidamente visível, leia o valor da MIC no ponto de interseção entre a borda da elipse de inibição e a tira de teste E. Use o Guia de leitura de teste E e outros guias técnicos para ler corretamente diferentes padrões. A tira Etest (AB Biodisk, Solna, Suécia) contendo cefepima (faixa de teste MIC, 0,25-16 mg/L) e cefepima (faixa de teste MIC, 0,064-4 mg/L) mais 4 mg/L de ácido clavulânico será usada para detectar a expressão de ESBL de acordo com as instruções do fabricante. A redução de MIC em ≥3 diluições duplas na presença de ácido clavulânico é um indicador da produção de ESBL. A deformação das elipses ou a presença de zona "fantasma" também é indicador de produção de ESBL, mesmo que a relação MIC seja <8 ou não possa ser lida.
   • Controle de qualidade Para verificar o sistema com relação ao manuseio correto, qualidade e consistência dos materiais e métodos, teste as cepas de controle de qualidade com os antibióticos em questão. S. pneumoniae e H. influenzae podem ser determinados por microdiluição em caldo sob incubação ambiente. Os seguintes organismos estão incluídos como cepas de controle: S. aureus ATCC 29213, E. faecalis ATCC 29212, S. pneumoniae ATCC 49619, E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218, K. pneumoniae ATCC 700603 e P. aeruginosa ATCC 27853. Para cada 500 Etests realizados, será feito um teste de controle incluindo as 5 cepas de controle acima.
   • Estudos moleculares Isolados com expressão de ESBLs serão posteriormente tipados usando o método de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). Os procedimentos detalhados de PFGE e as interpretações dos padrões de bandas de PFGE são como a descrição em nosso relatório anterior (13).

Análise de dados

Os isolados são categorizados em suscetíveis, intermediários e resistentes de acordo com as diretrizes fornecidas pelo CLSI. Os isolados intermediários ou resistentes aos antimicrobianos também são categorizados como não susceptíveis aos agentes. As taxas de não suscetibilidade entre os principais patógenos bacterianos serão analisadas de acordo com os diferentes sítios de infecção e origem dos isolados. Serão analisadas as associações entre área geográfica, tipos de hospitais de onde esses isolados foram obtidos e a suscetibilidade antimicrobiana.