Forekomsten av utvidet spektrum β-laktamase (ESBL) som produserer isolater blant vanlige Enterobacteriaceae i Taiwan

Materialer og metoder

1. Innsamling av bakterieisolater

   Staben i National Health Research Institute har etablert en langsiktig overvåking av antimikrobiell resistens fra 22 til 44 sykehus fordelt i alle deler av Taiwan-Taiwan Surveillance of Antimicrobial Resistance (TSAR) siden 1998. Det har blitt utført fem ganger i år 1998, 2000, 2002, 2004 og 2006 og ble navngitt som TSAR-I, TSAR-II, TSAR-III, TSAR-IV og TSAR-V. I denne studien vil isolater av Enterobacteriaceas fra TSAR-IV rekrutteres. Hvert 50 isolater av Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens og Morganella morganii vil bli registrert (omtrent 10 % av de TSAR IV-samlede isolatene) for følgende mikrobiologiske studier.

   Isolater vil bli delt inn i ESBL-produserende eller ikke-produserende grupper ved screeningtester. Alle tilgjengelige isolater ble identifisert til arts- eller slektsnivå ved hjelp av konvensjonelle metoder. Isolater med samme art gjenvunnet fra samme individuelle pasient, regnes som ett isolat. Isolatene ble alle lagret ved -70 ℃ i trypticase soyabuljong (Difco Laboratories, Detroit, MI) supplert med 15 % glyserol før de ble testet.

2. Datainnsamling

   Informasjon samlet inn for hvert isolat inkluderte: innsamlingsdato, testdato, identifikasjon, infeksjonssted, pasientens sykehusenhet og om isolatet ble anskaffet i samfunnet (dvs. prøven tatt <48 timer etter innleggelse), lengden på pasientens sykehusopphold. Mottakbarheten til alle de isolerte mot målrettede antimikrobielle midler vil bli bestemt av deres Minimum Inhibitory Concentration (MIC-verdier) og følge CLSI-bruddpunktene for respektive antimikrobielt middel.

3. Antimikrobiell følsomhetstesting

   • Inokulumpreparering Sterilt saltvann (0,85 % NaCl), egnet buffer eller buljong for inokulumpreparering, avhengig av organismen. CLSI-inokulumprosedyren for aerobe og andre mikroorganismer bør brukes. 0,5 McFarland turbiditet vil bli brukt som standard for aerobe.
   • Inokulering Bruk sterile løkker/pinner for å oppnå optimal mengde inokulumsuspensjon. Vaske hele agaroverflaten tre ganger; roter platen ca. 90 grader hver gang for å sikre en jevn fordeling av inokulum. La overflødig fuktighet absorberes i ca. 10-15 minutter slik at overflaten er helt tørr før du påfører E teststrimler.
   • Påføring av E-teststrimler Sørg for at den inokulerte agaroverflaten er helt tørr før påføring av E-teststrimler. Bruk en Etest-applikator eller bruk en pinsett til å ta tak i håndtaket på stripen (er merket E) og plasser dem på den inokulerte agaroverflaten, og sørg for at MIC-skalaen vender oppover og at maksimumskonsentrasjonen er nærmest kanten av tallerken. Sørg for at hele stripen er i full kontakt med agaroverflaten. Etter påføring kan ikke stripen flyttes på grunn av umiddelbar frigjøring av antibiotika inn i agaren. Det anbefales å påføre 4-6 forskjellige E-teststrimler på en 150 m agarplate. I denne studien vil E-teststrimlene av seks antimikrobielle midler, inkludert cefepim, cefepim pluss klavulansyre (for identifisering av ESBL-produserende isolater), ciprofloksacin, cefmetazol, amikacin, tigecyklin bli brukt i tillegg til ertapenem.
   • Inkubasjon Inkubasjonstemperaturen og atmosfæren som brukes må være optimal for vekst av bestemte bakteriearter og antibiotikumet som testes. CLSI anbefaler 35 ℃/16-18 timer/omgivende atmosfære for ikke-krese aerober og fakultative anaerober.
   • Lesing av MIC Etter fullført inkubasjonsperiode og når bakterievekst blir tydelig synlig, les MIC-verdien ved skjæringspunktet mellom inhiberingsellipsekanten og E-teststrimmelen. Bruk E-testleseguiden og andre tekniske veiledninger for å lese forskjellige mønstre korrekt. Etest-strimmel (AB Biodisk, Solna, Sverige) som inneholder cefepim (MIC-testområde, 0,25-16 mg/L) og cefepim (MIC-testområde, 0,064-4 mg/L) pluss 4 mg/L clavulansyre vil bli brukt for å påvise uttrykket av ESBL i henhold til produsentens instruksjoner. reduksjon av MIC med ≥3 to ganger fortynninger i nærvær av klavulansyre er en indikator på ESBL-produksjon. Deformasjon av ellipsene eller tilstedeværelsen av "fantom"-sone er også en indikator på ESBL-produksjon selv om MIC-forholdet er <8 eller ikke kan leses.
   • Kvalitetskontroll For å kontrollere systemet med hensyn til korrekt håndtering, kvalitet og konsistens av materialer og metoder, test kvalitetskontrollstammer med de aktuelle antibiotika. S. pneumoniae og H. influenzae kan bestemmes ved buljongmikrofortynning under inkubasjon i omgivelsene. Følgende organismer er inkludert som kontrollstammer: S. aureus ATCC 29213, E. faecalis ATCC 29212, S. pneumoniae ATCC 49619, E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218, K. pneumoniae, Pneumoniae 060AT, Pneumoniae 7, 0619 og Pneumoniae. 27853. For hver 500 utførte Etester, vil en kontrolltest som inkluderer de 5 kontrollstammene ovenfor bli utført.
   • Molekylære studier Isolater med ekspresjon av ESBLer vil bli videretypet ved hjelp av Pulsed Field gel electrophoresis (PFGE) metode. De detaljerte prosedyrene for PFGE og tolkningene av PFGE-båndmønstre er som beskrivelsen i vår forrige rapport (13).

Dataanalyse

Isolater er kategorisert i følsomme, middels og resistente i henhold til retningslinjene gitt av CLSI. Isolater som er middels eller resistente mot antimikrobielle midler er også kategorisert som ikke-mottakelige for midlene. Graden av ikke-mottakelighet blant store bakterielle patogener vil bli analysert i henhold til de forskjellige infeksjonsstedene og opprinnelsen til isolatene. Assosiasjonene mellom geografisk område, sykehustyper som disse isolatene ble hentet fra mot den antimikrobielle følsomheten vil bli analysert.