La prevalenza degli isolati produttori di β-lattamasi a spettro esteso (ESBL) tra le Enterobacteriaceae comuni a Taiwan

Materiali e metodi

1. Raccolta di isolati batterici

   Il personale del National Health Research Institute ha stabilito una sorveglianza a lungo termine della resistenza antimicrobica da 22 a 44 ospedali distribuiti in tutte le parti del Taiwan-Taiwan Surveillance of Antimicrobial Resistance (TSAR) dal 1998. È stato condotto cinque volte negli anni 1998, 2000, 2002, 2004 e 2006 ed è stato denominato TSAR-I, TSAR-II, TSAR-III, TSAR-IV e TSAR-V. In questo studio verranno reclutati isolati di Enterobacteriaceas da TSAR-IV. Ogni 50 isolati di Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens e Morganella morganii saranno arruolati (circa il 10% degli isolati TSAR IV raccolti) per i seguenti studi microbiologici.

   Gli isolati saranno divisi in gruppi produttori o non produttori di ESBL mediante test di screening. Tutti gli isolati disponibili sono stati identificati a livello di specie o genere mediante metodi convenzionali. Gli isolati con la stessa specie recuperati dallo stesso un singolo paziente, sono considerati un isolato. Gli isolati sono stati tutti conservati a -70 ℃ in brodo di soia tripticasi (Difco Laboratories, Detroit, MI) integrato con glicerolo al 15% prima di essere testati.

2. Raccolta dati

   Le informazioni raccolte per ciascun isolato includevano: data di raccolta, data del test, identificazione, sito di infezione, unità ospedaliera del paziente e se l'isolato è stato acquisito nella comunità (ad esempio, campione ottenuto <48 ore dopo il ricovero), la durata del soggiorno del paziente degenza ospedaliera. La suscettibilità di tutti gli isolati contro agenti antimicrobici mirati sarà determinata dalla loro concentrazione minima inibitoria (valori MIC) seguendo i breakpoint CLSI per il rispettivo agente antimicrobico.

3. Test di sensibilità antimicrobica

   • Preparazione degli inoculi Soluzione fisiologica sterile (0,85% NaCl), tampone o brodo adatto per la preparazione degli inoculi, a seconda dell'organismo. Deve essere utilizzata la procedura di inoculo CLSI per aerobi e altri microrganismi. La torbidità di 0,5 McFarland sarà utilizzata come standard per gli aerobi.
   • Inoculazione Utilizzare anse/tamponi sterili per ottenere una quantità ottimale di sospensione di inoculi. Tamponare l'intera superficie dell'agar tre volte; ruotando ogni volta la piastra di circa 90 gradi per garantire una distribuzione uniforme degli inoculi. Lasciare assorbire l'umidità in eccesso per circa 10-15 minuti in modo che la superficie sia completamente asciutta prima di applicare le strisce reattive E.
   • Applicazione delle strisce reattive E Assicurarsi che la superficie dell'agar inoculato sia completamente asciutta prima di applicare le strisce reattive E. Utilizzare un applicatore Etest o utilizzare una pinza per afferrare l'impugnatura della striscia (sono etichettati E) e posizionarli sulla superficie dell'agar inoculato, assicurandosi che la scala MIC sia rivolta verso l'alto e che la concentrazione massima sia più vicina al bordo della piatto. Assicurarsi che l'intera striscia sia completamente a contatto con la superficie dell'agar. Una volta applicata, la striscia non può essere spostata a causa del rilascio istantaneo dell'antibiotico nell'agar. Si consiglia di applicare 4-6 diverse strisce reattive E su una piastra di agar da 150 m. In questo studio, le strisce reattive E di sei agenti antimicrobici, tra cui cefepime, cefepime più acido clavulanico (per l'identificazione di isolati produttori di ESBL), ciprofloxacina, cefmetazolo, amikacina, tigeciclina verranno applicate in aggiunta a ertapenem.
   • Incubazione La temperatura e l'atmosfera di incubazione utilizzate devono essere ottimali per la crescita di particolari specie batteriche e per l'antibiotico in esame. CLSI raccomanda 35℃/16-18 ore/atmosfera ambiente per aerobi non esigenti e anaerobi facoltativi.
   • Lettura della MIC Dopo aver completato il periodo di incubazione e quando la crescita batterica diventa chiaramente visibile, leggere il valore della MIC nel punto di intersezione tra il bordo dell'ellisse di inibizione e la striscia reattiva E. Usa la Guida alla lettura del test E e altre guide tecniche per leggere correttamente diversi modelli. La striscia Etest (AB Biodisk, Solna, Svezia) contenente cefepime (intervallo di test MIC, 0,25-16 mg/L) e cefepime (intervallo di test MIC, 0,064-4 mg/L) più 4 mg/L di acido clavulanico verrà utilizzata per rilevare l'espressione di ESBL secondo le istruzioni del produttore. La riduzione della MIC di ≥3 diluizioni doppie in presenza di acido clavulanico è un indicatore della produzione di ESBL. Anche la deformazione delle ellissi o la presenza di zone "fantasma" sono indicatori di produzione di ESBL anche se il rapporto MIC è <8 o non può essere letto.
   • Controllo di qualità Per controllare il sistema rispetto alla corretta manipolazione, qualità e coerenza dei materiali e dei metodi, testare i ceppi di controllo di qualità con gli antibiotici interessati. S. pneumoniae e H. influenzae possono essere determinati mediante microdiluizione del brodo in incubazione ambientale. I seguenti microrganismi sono inclusi come ceppi di controllo: S. aureus ATCC 29213, E. faecalis ATCC 29212, S. pneumoniae ATCC 49619, E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218, K. pneumoniae ATCC 700603 e P. aeruginosa ATCC 27853. Per ogni 500 Etest eseguiti, verrà eseguito un test di controllo che includa i 5 ceppi di controllo di cui sopra.
   • Studi molecolari Gli isolati con espressione di ESBL saranno ulteriormente tipizzati utilizzando il metodo dell'elettroforesi su gel a campo pulsato (PFGE). Le procedure dettagliate di PFGE e le interpretazioni dei modelli di bande PFGE sono come la descrizione nel nostro precedente rapporto (13).

Analisi dei dati

Gli isolati sono classificati in suscettibili, intermedi e resistenti secondo le linee guida fornite dal CLSI. Anche gli isolati intermedi o resistenti agli agenti antimicrobici sono classificati come non sensibili agli agenti. I tassi di non suscettibilità tra i principali patogeni batterici saranno analizzati in base ai diversi siti di infezione e all'origine degli isolati. Verranno analizzate le associazioni tra area geografica, tipologie ospedaliere da cui questi isolati sono stati ottenuti contro la suscettibilità antimicrobica.