Występowanie izolatów wytwarzających β-laktamazę o rozszerzonym spektrum (ESBL) wśród pospolitych Enterobacteriaceae na Tajwanie

Materiały i metody

1. Kolekcja izolatów bakteryjnych

   Od 1998 roku pracownicy Narodowego Instytutu Badań Zdrowia ustanowili długoterminowy nadzór nad opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe w 22 do 44 szpitalach rozmieszczonych we wszystkich częściach tajwańsko-tajwańskiego nadzoru nad opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe (TSAR). Został on przeprowadzony pięć razy w latach 1998, 2000, 2002, 2004 i 2006 i otrzymał nazwy TSAR-I, TSAR-II, TSAR-III, TSAR-IV i TSAR-V. W tym badaniu będą rekrutowane izolaty Enterobacteriace z TSAR-IV. Każde 50 izolatów Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens i Morganella morganii zostanie włączonych (około 10% izolatów zebranych TSAR IV) do kolejnych badań mikrobiologicznych.

   Izolaty zostaną podzielone na grupy produkujące lub nie produkujące ESBL za pomocą testów przesiewowych. Wszystkie dostępne izolaty zostały zidentyfikowane do poziomu gatunku lub rodzaju metodami konwencjonalnymi. Izolaty tego samego gatunku wyizolowane od tego samego pacjenta uważa się za jeden izolat. Wszystkie izolaty były przechowywane w temperaturze -70 ℃ w bulionie tryptokazowo-sojowym (Difco Laboratories, Detroit, MI) z dodatkiem 15% glicerolu przed testowaniem.

2. Gromadzenie danych

   Informacje zebrane dla każdego izolatu obejmowały: datę pobrania, datę testu, identyfikację, miejsce zakażenia, oddział szpitalny pacjenta oraz to, czy izolat został pozyskany w środowisku (tj. próbka pobrana <48 godzin po przyjęciu), długość życia pacjenta pobyt w szpitalu. Wrażliwość wszystkich wyizolowanych na ukierunkowane środki przeciwdrobnoustrojowe zostanie określona na podstawie ich minimalnego stężenia hamującego (wartości MIC) zgodnie z wartościami granicznymi CLSI dla odpowiedniego środka przeciwdrobnoustrojowego.

3. Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe

   • Przygotowanie inokulum Sterylna sól fizjologiczna (0,85% NaCl), odpowiedni bufor lub bulion do przygotowania inokulum, w zależności od organizmu. Należy zastosować procedurę inokulum CLSI dla bakterii tlenowych i innych mikroorganizmów. Mętność 0,5 McFarlanda będzie używana jako standard dla aerobów.
   • Inokulacja Użyć sterylnych ezy/wymazówek w celu uzyskania optymalnej ilości zawiesiny inokulum. Przetrzeć całą powierzchnię agaru trzy razy; obracając płytkę za każdym razem o około 90 stopni, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie inokulum. Pozostaw nadmiar wilgoci na około 10-15 minut, aby powierzchnia była całkowicie sucha przed nałożeniem pasków testowych E.
   • Nakładanie pasków testowych E Przed nałożeniem pasków testowych E upewnij się, że zaszczepiona powierzchnia agaru jest całkowicie sucha. Za pomocą aplikatora Etest lub pęsety chwyć uchwyt paska (oznaczony E) i umieść go na zaszczepionej powierzchni agaru, upewniając się, że skala MIC jest skierowana do góry, a maksymalne stężenie znajduje się najbliżej krawędzi płyta. Upewnij się, że cały pasek całkowicie styka się z powierzchnią agaru. Po nałożeniu paska nie można go przesuwać ze względu na natychmiastowe uwalnianie antybiotyku do agaru. Zaleca się nałożenie 4-6 różnych pasków testowych E na 150 µm płytkę agarową. W tym badaniu oprócz ertapenemu zostaną zastosowane paski testowe E sześciu środków przeciwdrobnoustrojowych, w tym cefepimu, cefepimu i kwasu klawulanowego (do identyfikacji izolatów wytwarzających ESBL), cyprofloksacyny, cefmetazolu, amikacyny, tygecykliny.
   • Inkubacja Temperatura i atmosfera inkubacji muszą być optymalne dla wzrostu poszczególnych gatunków bakterii i badanego antybiotyku. CLSI zaleca 35 ℃/16-18 godzin/atmosferę otoczenia dla niewybrednych tlenowców i fakultatywnych beztlenowców.
   • Odczyt wartości MIC Po zakończeniu okresu inkubacji, gdy wzrost bakterii stanie się wyraźnie widoczny, należy odczytać wartość MIC w punkcie przecięcia się krawędzi elipsy hamowania z paskiem testowym E. Skorzystaj z Przewodnika po testach E i innych przewodników technicznych, aby poprawnie odczytać różne wzorce. Do wykrywania ekspresja ESBL zgodnie z instrukcją producenta. zmniejszenie MIC o ≥3 dwukrotne rozcieńczenia w obecności kwasu klawulanowego jest wskaźnikiem produkcji ESBL. Deformacja elips lub obecność strefy „fantomowej” jest również wskaźnikiem produkcji ESBL, nawet jeśli współczynnik MIC wynosi <8 lub nie można go odczytać.
   • Kontrola jakości W celu sprawdzenia systemu pod kątem prawidłowego podania, jakości i spójności materiałów oraz metod należy przebadać szczepy kontroli jakości z odpowiednimi antybiotykami. S. pneumoniae i H. influenzae można oznaczyć przez mikrorozcieńczenie bulionu w warunkach inkubacji w temperaturze pokojowej. Jako szczepy kontrolne uwzględniono następujące organizmy: S. aureus ATCC 29213, E. faecalis ATCC 29212, S. pneumoniae ATCC 49619, E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218, K. pneumoniae ATCC 700603 i P. aeruginosa ATCC 27853. Na każde 500 wykonanych Etestów zostanie przeprowadzony test kontrolny obejmujący 5 powyższych szczepów kontrolnych.
   • Badania molekularne Izolaty z ekspresją ESBL będą dalej typowane przy użyciu metody elektroforezy żelowej w polu pulsacyjnym (PFGE). Szczegółowe procedury PFGE i interpretacje wzorców prążków PFGE są zgodne z opisem w naszym poprzednim raporcie (13).

Analiza danych

Izolaty są podzielone na wrażliwe, pośrednie i oporne zgodnie z wytycznymi CLSI. Izolaty pośrednie lub oporne na środki przeciwdrobnoustrojowe są również klasyfikowane jako niewrażliwe na te środki. Wskaźniki niewrażliwości wśród głównych patogenów bakteryjnych zostaną przeanalizowane zgodnie z różnymi miejscami infekcji i pochodzeniem izolatów. Zostaną przeanalizowane powiązania między obszarem geograficznym, typami szpitali, z których uzyskano te izolaty, a wrażliwością na środki przeciwdrobnoustrojowe.