子宫内膜细胞因子基因表达的分子定量和测序及其对体外受精 (IVF) 周期结果影响的初步研究

该研究将进行

在开罗IVE单位；开罗大学医学院 15 例。 纳入标准：年龄23岁-35岁，FSH小于10，既往无子宫手术史，无既往IVF不良反应史，无严重男性因素，无子宫内膜异位症，排除子宫因素。 没有糖尿病和窦卵泡数 (AFC) > 5 使用标准长方案进行 IVF。

所有患者都将知情同意参与该研究。 子宫内膜组织样本将在取卵当天使用软抽吸塑料导管采集。 取10例月经周期规律、无明显子宫内膜功能异常的女性经血作为对照样本。 研究方案和知情同意书由 IVF 部门的人类伦理委员会批准。 卡萨伊尼医院

总 RNA 分离：子宫内膜活检和月经对照血将通过 RLT 缓冲液（QIAGEN，Germantown，MD）裂解。 根据制造商的说明，使用 RNeasy 迷你试剂盒（QIAGEN，Germantown，MD）进一步制备裂解物用于总 RNA 提取。 RNA 提取物储存在 -80ºC 以备将来使用。 RNA 纯度、产量和浓度将通过双分光光度法（贝克曼，美国）确定，1 微克 RNA 在 1% 琼脂糖凝胶（罗氏，澳大利亚城堡山）上运行，以确保 RNA 的完整性。 定量 RT-PCR (qRT-PCR)：使用高容量逆转录酶试剂盒（Applied Biosystems，美国）的逆转录酶 (RT) 反应混合物，其中包含：每个样本的 1 μg 总 RNA 用于 cDNA 合成，0.5 μg 随机引物，5×RT缓冲液、2.5 mmol/L dNTP、20 U RNase 抑制剂和 200 U MMLV 逆转录酶在总体积 25 μl 中在 37ºC 下孵育 60 分钟，然后加热至 95ºC 5 分钟以灭活 MMLV。 RT 之后是 qPCR，将 50 ng cDNA 添加到 5 X Fast-Start SYBR green master mix with Rox（Roche Diagnostics，Indianapolis，IN）和 200 ng 引物混合物（Sigma）。 该反应将在微型光学板（Applied Biosystems）中进行，并使用 StepOne 实时 203 PCR 系统（Applied Biosystems）进行分析。 PCR运行方法如下：在950℃下10分钟用于酶活化，随后进行40个循环，950℃下15秒，550℃下20秒和720℃下30秒用于扩增步骤。 qRT-PCR 评估中使用的引物对目标基因具有特异性（表 1）。 通过比较循环阈值法计算相对mRNA表达量。 如制造商的用户手册中所述，使用 GAPDH 管家基因。 将荧光对反应的 PCR 循环数作图，并指出每个样品。 血清激素水平测定：FSH、LH和E2根据制造商的说明通过ELISA进行估计。 DNA 纯化和测序分析：IL-11 和 LIF 基因通过使用 SEQr 试剂盒对 PCR 产物直接测序进行分析。 (Applied Biosystems)，根据制造商的协议。 使用 QIAquick 凝胶提取试剂盒 (QIAGEN) 纯化 PCR 产物。 所有病例和对照的相关纯化 DNA 样本将在 Big Dye Terminator 测序试剂盒（PE/Applied Biosystems，Foster City，CA）的帮助下使用自动测序进行扩增和测序。 样本将在自动测序仪 ABI Prism 310 Avant (PE/Applied Biosystems) 中运行。 所有样品将进行两次测序以确保结果。

统计分析：数据将根据平均标准偏差、中位数和范围进行统计描述。 使用独立样本的 Mann Whitney U 检验对能够怀孕的女性和不能怀孕的女性进行比较。 使用非正态变量的 Spearman 秩相关方程完成各种变量之间的相关性。