Estudio piloto sobre cuantificación molecular y secuenciación de la expresión génica de citocinas endometriales y su efecto sobre el resultado del ciclo de fecundación in vitro (FIV)

El estudio se realizará

en la Unidad IVE de El Cairo; Facultad de medicina de la Universidad de El Cairo en 15 casos. Criterios de inclusión: edad de 23 a 35 años, FSH inferior a 10, sin operaciones uterinas previas, sin antecedentes de mala respuesta en FIV anteriores, sin factor masculino grave, sin endometriosis y factor uterino. sin diabetes mellitus y recuento de folículos antrales (AFC) > 5 sometidos a FIV utilizando un protocolo largo estándar.

Todos los pacientes darán su consentimiento informado para participar en el estudio. Se tomarán muestras de tejido endometrial el día de la extracción de ovocitos utilizando un catéter plástico de succión suave. Se tomó como muestra de control la sangre menstrual de 10 mujeres con ciclos menstruales regulares y sin disfunción endometrial aparente. El protocolo del estudio y los consentimientos informados fueron aprobados por el Comité de Ética Humana del departamento de FIV. hospital kasar ini

Aislamiento de ARN total: las biopsias endometriales y la sangre de control menstrual se lisarán con tampón RLT (QIAGEN, Germantown, MD). Los lisados ​​se prepararon adicionalmente para la extracción de ARN total usando el mini kit RNeasy (QIAGEN, Germantown, MD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El extracto de ARN almacenado a -80ºC hasta su uso futuro. La pureza, el rendimiento y la concentración del ARN se determinarán mediante espectrofotometría dual (Beckman, EE. UU.) y 1 μg de ARN en un gel de agarosa al 1 % (Roche, Castle Hill, Australia) para garantizar la integridad del ARN. RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR): mezcla de reacción de transcriptasa inversa (RT) utilizando el kit de transcriptasa inversa de alta capacidad (Applied Biosystems, EE. UU.) que contiene: 1 μg de ARN total de cada muestra para la síntesis de ADNc, 0,5 μg de cebador aleatorio, 5×RT tampón, 2,5 mmol/L de dNTP, 20 U de inhibidor de RNasa y 200 U de transcriptasa inversa de MMLV en un volumen total de 25 μl se incubó a 37 ºC durante 60 minutos, luego se calentó a 95 ºC durante 5 minutos para inactivar MMLV. La RT será seguida por qPCR, se agregaron 50 ng de ADNc a la mezcla maestra verde 5 X Fast-Start SYBR con Rox (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN) y 200 ng de mezcla de cebadores (Sigma). La reacción se llevará a cabo en microplacas ópticas (Applied Biosystems) y se analizará mediante el sistema StepOne real-time 203 PCR (Applied Biosystems). El método de ejecución de la PCR fue el siguiente: 10 minutos a 950C para la activación de la enzima seguido de 40 ciclos de 15 segundos a 950C, 20 segundos a 550C y 30 segundos a 720C para el paso de amplificación. Los cebadores utilizados en la evaluación qRT-PCR específicos para los genes diana (tabla 1). La expresión relativa de ARNm se calculará mediante el método de umbral de ciclo comparativo. como se describe en el manual de usuario del fabricante con el gen de limpieza GAPDH. Se representó gráficamente la fluorescencia frente al número de ciclos de PCR para la reacción y se indicó cada muestra. Ensayo de niveles hormonales en suero: FSH, LH y E2 se estimaron mediante ELISA de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Purificación de ADN y análisis de secuenciación: genes IL-11 y LIF analizados mediante secuenciación directa de los productos de PCR utilizando el kit SEQr. (Applied Biosystems), según protocolo del fabricante. Los productos de la PCR se purificarán con el QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). Las muestras de ADN purificado relevantes de todos los casos y controles se amplificarán y secuenciarán mediante secuenciación automatizada con la ayuda de un kit de secuenciación Big Dye Terminator (PE/Applied Biosystems, Foster City, CA). Las muestras se procesarán en un secuenciador automatizado ABI Prism 310 Avant (PE/Applied Biosystems). Todas las muestras se secuenciarán dos veces para garantizar los resultados.

Análisis estadístico: los datos se describirán estadísticamente en términos de desviación estándar media, mediana y rango. La comparación entre las mujeres que pudieron lograr el embarazo y las que no, se realizó mediante la prueba U de Mann Whitney para muestras independientes. La correlación entre varias variables se realizó utilizando la ecuación de correlación de rango de Spearman para variables no normales.