Pilotstudie over moleculaire kwantificering en sequentiebepaling van endometriale cytokine-genexpressie en hun effect op de uitkomst van de in-vitrofertilisatiecyclus (IVF)

De studie zal worden uitgevoerd

in de Caïro IVE-eenheid; Faculteit der geneeskunde Universiteit van Caïro op 15 gevallen. Inclusiecriteria: leeftijd 23 -35, FSH minder dan 10 geen eerdere baarmoederoperaties, geen voorgeschiedenis van slechte respons bij eerdere IVF geen ernstige mannelijke factor geen endometriose en baarmoederfactor zijn uitgesloten. geen diabetes mellitus en aantal antrale follikels (AFC) > 5 IVF ondergaan volgens standaard lang protocol.

Alle patiënten zullen hun geïnformeerde toestemming geven om deel te nemen aan het onderzoek. Op de dag van de eicelpunctie worden endometriumweefselmonsters genomen met behulp van een plastic katheter met zachte zuigkracht. Het menstruatiebloed van 10 vrouwen met regelmatige menstruatiecycli en zonder duidelijke endometriumdisfunctie werd genomen als controlemonsters. Het onderzoeksprotocol en de geïnformeerde toestemmingen werden goedgekeurd door de Human Ethics Committee van de IVF-afdeling .of Kasar Ini-ziekenhuis

Totale RNA-isolatie: endometriumbiopten en menstrueel controlebloed zullen worden gelyseerd door RLT-buffer (QIAGEN, Germantown, MD). De lysaten werden verder bereid voor totale RNA-extractie met behulp van de RNeasy minikit (QIAGEN, Germantown, MD) volgens de instructies van de fabrikant. Het RNA-extract bewaard bij -80ºC tot toekomstig gebruik. RNA-zuiverheid, opbrengst en concentratie zullen worden bepaald door middel van dubbele spectrofotometrie (Beckman, VS), en 1 μg RNA wordt uitgevoerd op een 1% agarosegel (Roche, Castle Hill, Australië) om de integriteit van het RNA te waarborgen. Kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR): Reverse transcriptase (RT)-reactiemengsel met behulp van High Capacity Reverse Transcriptase-kit (Applied Biosystems, VS) met: 1 μg totaal RNA van elk monster voor cDNA-synthese, 0,5 μg willekeurige primer, 5×RT buffer, 2,5 mmol/L dNTP, 20 U RNase-remmer en 200 U MMLV reverse transcriptase in een totaal volume van 25 μl werd gedurende 60 minuten bij 37°C geïncubeerd en vervolgens gedurende 5 minuten verwarmd tot 95°C om MMLV te inactiveren. RT zal worden gevolgd door qPCR, 50 ng cDNA werd toegevoegd aan 5 X Fast-Start SYBR groene mastermix met Rox (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) en 200 ng primermix (Sigma). De reactie zal worden uitgevoerd in micro-optische platen (Applied Biosystems) en geanalyseerd met behulp van StepOne real-time 203 PCR-systeem (Applied Biosystems). De PCR-loopmethode was als volgt: 10 minuten bij 95°C voor enzymactivering gevolgd door 40 cycli van 15 seconden bij 95°C, 20 seconden bij 55°C en 30 seconden bij 72°C voor de amplificatiestap. De primers gebruikt in de qRT-PCR-evaluatie specifiek voor doelgenen (tabel 1). Relatieve mRNA-expressie zal worden berekend met behulp van de vergelijkende cyclusdrempelmethode. zoals beschreven in de gebruikershandleiding van de fabrikant met het GAPDH-huishoudgen. De fluorescentie werd uitgezet tegen het PCR-cyclusnummer voor reactie en elk monster werd aangegeven. Test hormoonspiegels in serum: FSH, LH en E2 werden geschat door ELISA volgens de instructies van de fabrikant. DNA-zuivering en sequentieanalyse: IL-11- en LIF-genen geanalyseerd door directe sequentiebepaling van de PCR-producten met behulp van de SEQr-kit. (Applied Biosystems), volgens het protocol van de fabrikant. PCR-producten worden gezuiverd met behulp van de QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). De relevante gezuiverde DNA-monsters van alle gevallen en controles zullen worden geamplificeerd en gesequenced met behulp van geautomatiseerde sequencing met behulp van een Big Dye Terminator Sequencing Kit (PE/Applied Biosystems, Foster City, CA). De monsters worden uitgevoerd in een geautomatiseerde sequencer ABI Prism 310 Avant (PE/Applied Biosystems). Alle monsters worden tweemaal gesequenced om de resultaten te garanderen.

Statistische analyse: gegevens worden statistisch beschreven in termen van gemiddelde standaarddeviatie, mediaan en bereik. Vergelijking tussen vrouwen die zwanger konden worden en degenen die dat niet deden, werd gedaan met behulp van de Mann Whitney U-test voor onafhankelijke steekproeven. Correlatie tussen verschillende variabelen werd gedaan met behulp van de Spearman-rangcorrelatievergelijking voor niet-normale variabelen.