Pilottitutkimus endometriumin sytokiinien geeniekspressiosta ja niiden vaikutuksesta in vitro -hedelmöityssyklin (IVF) lopputulokseen

Tutkimus suoritetaan

Kairon IVE-yksikössä; Kairon yliopiston lääketieteellinen tiedekunta 15 tapauksesta. Sisällyttämiskriteerit: ikä 23-35, FSH alle 10 ei aikaisempia kohdun leikkauksia, ei aiemman IVF:n huonoa vastetta, ei miehistä tekijää, ei endometrioosia ja kohdun tekijää ei suljeta pois. ei diabetes mellitusta ja antural follikkelien määrä (AFC) > 5 IVF:ssä normaalia pitkää protokollaa käyttäen.

Kaikki potilaat antavat tietoisen suostumuksensa osallistua tutkimukseen. Kohdun limakalvon kudosnäytteet otetaan munasolun hakupäivänä käyttämällä pehmeää imumuovikatetria. Kontrollinäytteinä otettiin kuukautisveri 10 naiselta, joilla oli säännöllinen kuukautiskierto ja joilla ei ollut ilmeistä endometriumin toimintahäiriötä. Tutkimusprotokolla ja tietoiset suostumukset hyväksyttiin IVF-osaston ihmiseettisessä komiteassa Kasar Inin sairaala

RNA:n kokonaiseristys: Kohdun limakalvon biopsiat ja kuukautiskierron kontrolliveri hajotetaan RLT-puskurilla (QIAGEN, Germantown, MD). Lysaatit valmistettiin edelleen RNA:n kokonaisuuttoon käyttämällä RNeasy-minisarjaa (QIAGEN, Germantown, MD) valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA-uute säilytetty -80 ºC:ssa tulevaan käyttöön asti. RNA:n puhtaus, saanto ja pitoisuus määritetään kaksoisspektrofotometrialla (Beckman, USA) ja 1 μg RNA:ta ajetaan 1 % agaroosigeelillä (Roche, Castle Hill, Australia) RNA:n eheyden varmistamiseksi. Kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR): Käänteiskopioijaentsyymin (RT) reaktioseos High Capacity Reverse Transcriptase -pakkauksella (Applied Biosystems, USA), joka sisältää: 1 μg kokonais-RNA:ta kustakin näytteestä cDNA-synteesiä varten, 0,5 μg satunnaista aluketta, 5×RT puskuria, 2,5 mmol/l dNTP:tä, 20 U RNaasi-inhibiittoria ja 200 U MMLV-käänteiskopioijaentsyymiä 25 μl:n kokonaistilavuudessa inkuboitiin 37 ºC:ssa 60 minuuttia, sitten kuumennettiin 95 ºC:seen 5 minuuttia MMLV:n inaktivoimiseksi. RT:tä seuraa qPCR, 50 ng cDNA:ta lisättiin 5 X Fast-Start SYBR green master -seokseen Roxin kanssa (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) ja 200 ng alukeseosta (Sigma). Reaktio suoritetaan mikrooptisilla levyillä (Applied Biosystems) ja analysoidaan käyttämällä StepOne reaaliaikaista 203 PCR -järjestelmää (Applied Biosystems). PCR-ajomenetelmä oli seuraava: 10 minuuttia 950 °C:ssa entsyymiaktivaatiota varten, mitä seurasi 40 sykliä 15 sekuntia 950 °C:ssa, 20 sekuntia 550 °C:ssa ja 30 sekuntia 720 °C:ssa monistusvaihetta varten. Kohdegeeneille spesifiset qRT-PCR-arvioinnissa käytetyt alukkeet (taulukko 1). Suhteellinen mRNA:n ilmentyminen lasketaan vertailevalla syklin kynnysmenetelmällä. valmistajan GAPDH-talousgeenin käyttöoppaassa kuvatulla tavalla. Fluoresenssi piirrettiin PCR-syklin numeron funktiona reaktiolle ja jokainen näyte osoitettiin. Seerumin hormonitasojen määritys: FSH, LH ja E2 arvioitiin ELISA:lla valmistajien ohjeiden mukaisesti. DNA:n puhdistus ja sekvensointianalyysi: IL-11- ja LIF-geenit analysoitiin PCR-tuotteiden suoralla sekvensoinnilla käyttämällä SEQr-pakkausta. (Applied Biosystems), valmistajan protokollan mukaan. PCR-tuotteet puhdistetaan käyttämällä QIAquick Gel Extraction Kit -sarjaa (QIAGEN). Kaikkien tapausten ja kontrollien asiaankuuluvat puhdistetut DNA-näytteet monistetaan ja sekvensoidaan käyttämällä automaattista sekvensointia Big Dye Terminator Sequencing Kitin (PE/Applied Biosystems, Foster City, CA) avulla. Näytteet ajetaan automatisoidussa sekvensserissä ABI Prism 310 Avant (PE/Applied Biosystems). Kaikki näytteet sekvensoidaan kahdesti tulosten varmistamiseksi.

Tilastollinen analyysi: Tiedot kuvataan tilastollisesti keskimääräisen keskihajonnan, mediaanin ja vaihteluvälin avulla. Vertailu naisten välillä, jotka saattoivat tulla raskaaksi, ja niitä, jotka eivät tulleet raskaaksi, tehtiin Mann Whitneyn U-testillä riippumattomille näytteille. Eri muuttujien välinen korrelaatio tehtiin Spearmanin rankkorrelaatioyhtälön avulla ei-normaaleille muuttujille.