Estudo piloto sobre quantificação molecular e sequenciamento da expressão gênica de citocinas endometriais e seu efeito no resultado do ciclo de fertilização in vitro (FIV)

O estudo será realizado

na Unidade Cairo IVE; Faculdade de Medicina da Universidade do Cairo em 15 casos. Critérios de inclusão: idade 23-35, FSH inferior a 10 sem operações uterinas anteriores, sem história de má resposta em FIV anterior sem fator masculino severo sem endometriose e fator uterino excluídos. sem diabetes mellitus e contagem de folículos antrais (AFC) > 5 em FIV usando protocolo longo padrão.

Todos os pacientes darão seu consentimento informado para participar do estudo. Amostras de tecido endometrial serão coletadas no dia da coleta dos ovócitos usando cateter plástico de sucção macia. O sangue menstrual de 10 mulheres com ciclos menstruais regulares e sem disfunção endometrial aparente foi coletado como amostras de controle. O protocolo do estudo e os consentimentos informados foram aprovados pelo Comitê de Ética Humana do departamento de fertilização in vitro. Hospital Kasar Ini

Isolamento de RNA total: Biópsias endometriais e sangue de controle menstrual serão lisados ​​por tampão RLT (QIAGEN, Germantown, MD). Os lisados ​​foram posteriormente preparados para extração de RNA total usando o mini kit RNeasy (QIAGEN, Germantown, MD) de acordo com as instruções do fabricante. O extrato de RNA armazenado a -80ºC até uso futuro. A pureza, o rendimento e a concentração do RNA serão determinados por espectrofotometria dupla (Beckman, EUA) e 1μg de RNA executado em gel de agarose 1% (Roche, Castle Hill, Austrália) para garantir a integridade do RNA. RT-PCR quantitativo (qRT-PCR): mistura de reação da transcriptase reversa (RT) usando kit High Capacity Reverse Transcriptase (Applied Biosystems, EUA) contendo: 1 μg de RNA total de cada amostra para síntese de cDNA, 0,5 μg de primer aleatório, 5×RT tampão, 2,5 mmol/L dNTP, 20 U RNase inibidor e 200 U MMLV transcriptase reversa em um volume total de 25 μl foi incubado a 37ºC por 60 minutos, depois aquecido a 95 ºC por 5 minutos para inativar MMLV. RT será seguido por qPCR, 50 ng de cDNA foram adicionados a 5 X Fast-Start SYBR green master mix com Rox (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) e 200 ng de primer mix (Sigma). A reação será realizada em microplacas ópticas (Applied Biosystems) e analisadas pelo sistema StepOne real-time 203 PCR (Applied Biosystems). O método de execução da PCR foi o seguinte: 10 minutos a 950C para ativação da enzima seguido de 40 ciclos de 15 segundos a 950C, 20 segundos a 550C e 30 segundos a 720C para a etapa de amplificação. Os primers usados ​​na avaliação qRT-PCR específicos para genes-alvo (tabela 1). A expressão relativa de mRNA será calculada pelo método de limiar de ciclo comparativo. conforme descrito no manual do usuário do fabricante com gene de manutenção GAPDH. A fluorescência foi plotada versus o número do ciclo de PCR para a reação e cada amostra indicada. Ensaio dos níveis hormonais séricos: FSH, LH e E2 foram estimados por ELISA de acordo com as instruções dos fabricantes. Purificação de DNA e análise de sequenciamento: genes IL-11 e LIF analisados ​​por sequenciamento direto dos produtos de PCR usando kit SEQr. (Applied Biosystems), conforme protocolo do fabricante. Os produtos de PCR serão purificados usando o QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). As amostras de DNA purificadas relevantes de todos os casos e controles serão amplificadas e sequenciadas por meio de sequenciamento automatizado com o auxílio de um Big Dye Terminator Sequencing Kit (PE/Applied Biosystems, Foster City, CA). As amostras serão processadas em sequenciador automático ABI Prism 310 Avant (PE/Applied Biosystems). Todas as amostras serão sequenciadas duas vezes para garantir os resultados.

Análise estatística: Os dados serão descritos estatisticamente em termos de média, desvio padrão, mediana e variação. A comparação entre as mulheres que conseguiram engravidar e as que não conseguiram foi feita usando o teste Mann Whitney U para amostras independentes. A correlação entre várias variáveis ​​foi feita usando a equação de correlação de postos de Spearman para variáveis ​​não normais.