Étude pilote sur la quantification moléculaire et le séquençage de l'expression génique des cytokines endométriales et leur effet sur le résultat du cycle de fécondation in vitro (FIV)

L'étude sera réalisée

dans l'unité IVE du Caire ; Faculté de médecine Université du Caire sur 15 cas. Critères d'inclusion : 23 à 35 ans, FSH inférieure à 10 pas d'opérations utérines antérieures, aucun antécédent de mauvaise réponse lors d'une précédente FIV, aucun facteur masculin sévère, aucune endométriose et le facteur utérin sont exclus. pas de diabète sucré et nombre de follicules antraux (AFC)> 5 subissant une FIV en utilisant un protocole long standard.

Tous les patients donneront leur consentement éclairé pour participer à l'étude. Des échantillons de tissu endométrial seront prélevés le jour de la récupération des ovocytes à l'aide d'un cathéter en plastique à aspiration souple. Le sang menstruel de 10 femmes ayant des cycles menstruels réguliers et sans dysfonction endométriale apparente a été prélevé comme échantillons de contrôle. Le protocole d'étude et les consentements éclairés ont été approuvés par le comité d'éthique humaine du département de FIV. Hôpital Kasar Ini

Isolement de l'ARN total : les biopsies de l'endomètre et le sang de contrôle menstruel seront lysés par un tampon RLT (QIAGEN, Germantown, MD). Les lysats sont ensuite préparés pour l'extraction de l'ARN total à l'aide du mini kit RNeasy (QIAGEN, Germantown, MD) conformément aux instructions du fabricant. L'extrait d'ARN stocké à -80 ° C jusqu'à une utilisation future. La pureté, le rendement et la concentration de l'ARN seront déterminés par double spectrophotométrie (Beckman, États-Unis) et 1 μg d'ARN exécuté sur un gel d'agarose à 1 % (Roche, Castle Hill, Australie) pour assurer l'intégrité de l'ARN. RT-PCR quantitative (qRT-PCR) : Mélange réactionnel de transcriptase inverse (RT) utilisant le kit High Capacity Reverse Transcriptase (Applied Biosystems, USA) contenant : 1 μg d'ARN total de chaque échantillon pour la synthèse d'ADNc, 0,5 μg d'amorce aléatoire, 5×RT tampon, 2,5 mmol/L de dNTP, 20 U d'inhibiteur de RNase et 200 U de transcriptase inverse de MMLV dans un volume total de 25 μl a été incubé à 37 °C pendant 60 minutes, puis chauffé à 95 °C pendant 5 minutes pour inactiver le MMLV. La RT sera suivie d'une qPCR, 50 ng d'ADNc ont été ajoutés au mélange maître vert 5 X Fast-Start SYBR avec Rox (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) et 200 ng de mélange d'amorces (Sigma). La réaction sera effectuée dans des microplaques optiques (Applied Biosystems) et analysée à l'aide du système de PCR en temps réel StepOne 203 (Applied Biosystems). La méthode d'exécution de la PCR était la suivante : 10 minutes à 95°C pour l'activation enzymatique suivies de 40 cycles de 15 secondes à 95°C, 20 secondes à 55°C et 30 secondes à 72°C pour l'étape d'amplification. Les amorces utilisées dans l'évaluation qRT-PCR spécifiques des gènes cibles (tableau 1). L'expression relative de l'ARNm sera calculée par la méthode du seuil de cycle comparatif. comme indiqué dans le manuel d'utilisation du fabricant avec le gène d'entretien ménager GAPDH. La fluorescence a été tracée en fonction du nombre de cycles de PCR pour la réaction et chaque échantillon indiqué. Dosage des niveaux hormonaux sériques : FSH, LH et E2 ont été estimés par ELISA selon les instructions des fabricants. Purification de l'ADN et analyse de séquençage : Gènes IL-11 et LIF analysés par séquençage direct des produits PCR à l'aide du kit SEQr. (Applied Biosystems), selon le protocole du fabricant. Les produits de PCR seront purifiés à l'aide du kit d'extraction de gel QIAquick (QIAGEN). Les échantillons d'ADN purifiés pertinents de tous les cas et témoins seront amplifiés et séquencés à l'aide d'un séquençage automatisé à l'aide d'un kit de séquençage Big Dye Terminator (PE/Applied Biosystems, Foster City, CA). Les échantillons seront exécutés dans un séquenceur automatisé ABI Prism 310 Avant (PE/Applied Biosystems). Tous les échantillons seront séquencés deux fois pour garantir les résultats.

Analyse statistique : les données seront décrites statistiquement en termes d'écart-type moyen, de médiane et de plage. La comparaison entre les femmes qui pouvaient obtenir une grossesse et celles qui ne l'ont pas été a été effectuée à l'aide du test U de Mann Whitney pour des échantillons indépendants. La corrélation entre diverses variables a été effectuée à l'aide de l'équation de corrélation de rang de Spearman pour les variables non normales.