자궁내막 사이토카인 유전자 발현의 분자 정량 및 시퀀싱과 체외 수정(IVF) 주기 결과에 미치는 영향에 관한 파일럿 연구

연구가 수행될 것입니다.

카이로 IVE 유닛에서; 15건의 카이로 대학교 의과대학. 포함 기준: 23-35세, FSH 10 미만 이전 자궁 수술 없음, 이전 IVF에서 불량한 반응 이력 없음 심각한 남성 요인 없음 자궁내막증 없음 및 자궁 요인은 제외됩니다. 표준 긴 프로토콜을 사용하여 IVF를 받는 진성 당뇨병 및 antral follicle count(AFC) > 5 없음.

모든 환자는 연구 참여에 대한 사전 동의를 제공합니다. 자궁내막 조직 샘플은 연흡인 플라스틱 카테터를 사용하여 난자 채취 당일에 채취됩니다. 월경 주기가 규칙적이고 명백한 자궁 내막 기능 장애가 없는 10명의 여성의 월경 혈액을 대조 샘플로 사용했습니다. 연구 프로토콜 및 정보에 입각한 동의는 IVF 부서의 인간 윤리 위원회에 의해 승인되었습니다. 카사르 이니 병원

전체 RNA 분리: 자궁내막 생검 및 월경 대조군 혈액은 RLT 완충액(QIAGEN, Germantown, MD)에 의해 용해됩니다. 제조업체의 지침에 따라 RNeasy 미니 키트(QIAGEN, Germantown, MD)를 사용하여 전체 RNA 추출을 위해 추가로 용해물을 준비했습니다. RNA 추출물은 나중에 사용할 때까지 -80ºC에서 보관됩니다. RNA 순도, 수율 및 농도는 RNA의 무결성을 보장하기 위해 이중 분광광도계(Beckman, USA) 및 1% 아가로스 겔(Roche, Castle Hill, Australia)에서 실행되는 RNA 1μg을 통해 결정됩니다. 정량적 RT-PCR(qRT-PCR): 고용량 역전사효소 키트(Applied Biosystems, USA)를 사용한 역전사효소(RT) 반응 혼합물: cDNA 합성을 위한 각 샘플의 총 RNA 1μg, 무작위 프라이머 0.5μg, 5×RT 완충액, 2.5mmol/L dNTP, 20U RNase inhibitor 및 200U MMLV 역전사 효소 총 부피 25μl를 37ºC에서 60분 동안 배양한 다음 95ºC에서 5분간 가열하여 MMLV를 비활성화했습니다. RT는 qPCR로 이어지며, 50ng의 cDNA는 Rox(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) 및 200ng의 프라이머 믹스(Sigma)와 함께 5 X Fast-Start SYBR 그린 마스터 믹스에 첨가되었습니다. 반응은 마이크로 광학 플레이트(Applied Biosystems)에서 수행되고 StepOne 실시간 203 PCR 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 분석됩니다. PCR 실행 방법은 다음과 같다: 효소 활성화를 위해 950C에서 10분, 증폭 단계를 위해 950C에서 15초, 550C에서 20초 및 720C에서 30초의 40주기. 표적 유전자에 특이적인 qRT-PCR 평가에 사용된 프라이머(표 1). 상대 mRNA 발현은 비교 주기 임계값 방법으로 계산됩니다. GAPDH 하우스키핑 유전자가 포함된 제조업체의 사용 설명서에 설명된 대로. 형광은 반응에 대한 PCR 주기 수에 대해 플로팅되었고 각 샘플은 표시되었습니다. 혈청 호르몬 수치 분석: FSH, LH 및 E2는 제조업체의 지침에 따라 ELISA로 추정했습니다. DNA 정제 및 시퀀싱 분석: SEQr 키트를 사용하여 PCR 산물을 직접 시퀀싱하여 IL-11 및 LIF 유전자를 분석했습니다. (Applied Biosystems), 제조업체의 프로토콜에 따름. PCR 제품은 QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)를 사용하여 정제됩니다. Big Dye Terminator Sequencing Kit(PE/Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 자동 시퀀싱을 사용하여 모든 케이스 및 컨트롤의 관련 정제된 DNA 샘플을 증폭하고 시퀀싱합니다. 샘플은 자동 시퀀서 ABI Prism 310 Avant(PE/Applied Biosystems)에서 실행됩니다. 모든 샘플은 결과를 보장하기 위해 두 번 시퀀싱됩니다.

통계 분석: 데이터는 평균 표준 편차, 중앙값 및 범위의 관점에서 통계적으로 설명됩니다. 독립적인 샘플에 대해 Mann Whitney U 테스트를 사용하여 임신할 수 있는 여성과 그렇지 않은 여성을 비교했습니다. 비정규 변수에 대한 Spearman 순위 상관 방정식을 사용하여 다양한 변수 간의 상관 관계를 수행했습니다.