Badanie pilotażowe dotyczące molekularnej oceny ilościowej i sekwencjonowania ekspresji genów cytokin endometrialnych oraz ich wpływu na wynik cyklu zapłodnienia in vitro (IVF)

Badanie zostanie wykonane

w kairskim oddziale IVE; Wydział Lekarski Uniwersytetu Kairskiego w 15 przypadkach. Kryteria włączenia: wiek 23-35 lat, FSH poniżej 10 lat, brak przebytych operacji macicy, brak słabej odpowiedzi na poprzednie IVF, brak ciężkiego czynnika męskiego, wykluczenie endometriozy i czynnika macicy. brak cukrzycy i liczba pęcherzyków antralnych (AFC) > 5 poddawanych IVF przy użyciu standardowego długiego protokołu.

Wszyscy pacjenci wyrażą świadomą zgodę na udział w badaniu. Próbki tkanki endometrium zostaną pobrane w dniu pobrania komórki jajowej za pomocą miękkiego plastikowego cewnika ssącego. Krew menstruacyjną 10 kobiet z regularnymi cyklami miesiączkowymi i bez widocznej dysfunkcji endometrium pobrano jako próbki kontrolne. Protokół badania i świadome zgody zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Człowieka oddziału IVF Szpital Kasar Ini

Izolacja całkowitego RNA: Biopsje endometrium i kontrolna krew menstruacyjna zostaną poddane lizie buforem RLT (QIAGEN, Germantown, MD). Lizaty następnie przygotowano do ekstrakcji całkowitego RNA przy użyciu minizestawu RNeasy (QIAGEN, Germantown, MD) zgodnie z instrukcjami producenta. Ekstrakt RNA przechowywany w temperaturze -80ºC do wykorzystania w przyszłości. Czystość, wydajność i stężenie RNA zostaną określone za pomocą podwójnej spektrofotometrii (Beckman, USA) i 1 μg RNA przeprowadzony na 1% żelu agarozowym (Roche, Castle Hill, Australia), aby zapewnić integralność RNA. Ilościowa RT-PCR (qRT-PCR): Mieszanina reakcyjna odwrotnej transkryptazy (RT) przy użyciu zestawu High Capacity Reverse Transcriptase (Applied Biosystems, USA) zawierająca: 1 μg całkowitego RNA z każdej próbki do syntezy cDNA, 0,5 μg losowego startera, 5×RT bufor, 2,5 mmol/l dNTP, 20 U inhibitora RNazy i 200 U odwrotnej transkryptazy MMLV w całkowitej objętości 25 μl inkubowano w 37ºC przez 60 minut, następnie ogrzewano do 95ºC przez 5 minut w celu inaktywacji MMLV. Po RT nastąpi qPCR, 50 ng cDNA dodano do zielonej mieszanki głównej 5 X Fast-Start SYBR z Rox (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) i 200 ng mieszanki starterów (Sigma). Reakcja zostanie przeprowadzona na mikropłytkach optycznych (Applied Biosystems) i przeanalizowana przy użyciu systemu StepOne real-time 203 PCR (Applied Biosystems). Metoda przeprowadzania PCR była następująca: 10 minut w 95°C na aktywację enzymu, a następnie 40 cykli po 15 sekund w 95°C, 20 sekund w 55°C i 30 sekund w 72°C na etap amplifikacji. Startery użyte w ocenie qRT-PCR specyficzne dla docelowych genów (tabela 1). Względna ekspresja mRNA zostanie obliczona metodą porównawczego progu cyklu. jak opisano w podręczniku użytkownika producenta z genem utrzymującym dom GAPDH. Fluorescencję wykreślono w funkcji liczby cykli PCR dla reakcji i wskazano każdą próbkę. Oznaczanie poziomu hormonów w surowicy: FSH, LH i E2 oznaczano metodą ELISA zgodnie z zaleceniami producentów. Oczyszczanie DNA i analiza sekwencjonowania: geny IL-11 i LIF analizowano przez bezpośrednie sekwencjonowanie produktów PCR przy użyciu zestawu SEQr. (Applied Biosystems), zgodnie z protokołem producenta. Produkty PCR zostaną oczyszczone przy użyciu zestawu QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). Odpowiednie oczyszczone próbki DNA wszystkich przypadków i kontroli zostaną zamplifikowane i zsekwencjonowane przy użyciu automatycznego sekwencjonowania za pomocą zestawu Big Dye Terminator Sequencing Kit (PE/Applied Biosystems, Foster City, CA). Próbki zostaną poddane analizie w automatycznym sekwencerze ABI Prism 310 Avant (PE/Applied Biosystems). Wszystkie próbki zostaną zsekwencjonowane dwukrotnie, aby zapewnić wyniki.

Analiza statystyczna: Dane zostaną opisane statystycznie w kategoriach średniego odchylenia standardowego, mediany i zakresu. Porównanie kobiet, które mogły zajść w ciążę i tych, które tego nie zrobiły, przeprowadzono za pomocą testu U Manna Whitneya dla niezależnych próbek. Korelację między różnymi zmiennymi przeprowadzono za pomocą równania korelacji rang Spearmana dla zmiennych nienormalnych.