Pilotní studie o molekulární kvantifikaci a sekvenování genové exprese endometriálních cytokinů a jejich vlivu na výsledek cyklu fertilizace in vitro (IVF)

Studie bude provedena

v káhirské jednotce IVE; Lékařská fakulta Káhirské univerzity na 15 případech. Kritéria pro zařazení: věk 23 - 35 let, FSH nižší než 10 bez předchozích operací dělohy, bez anamnézy špatné odpovědi na předchozí IVF, žádný závažný mužský faktor, endometrióza a děložní faktor nejsou vyloučeny. žádný diabetes mellitus a počet antrálních folikulů (AFC) > 5 podstupující IVF pomocí standardního dlouhého protokolu.

Všichni pacienti dají svůj informovaný souhlas s účastí ve studii. Vzorky endometriální tkáně budou odebrány v den odběru oocytů pomocí měkkého sacího plastového katetru. Jako kontrolní vzorky byla odebrána menstruační krev 10 žen s pravidelnými menstruačními cykly a bez zjevné dysfunkce endometria. Protokol studie a informované souhlasy byly schváleny humánní etickou komisí oddělení IVF nemocnice Kasar Ini

Izolace celkové RNA: Endometriální biopsie a menstruační kontrolní krev budou lyžovány RLT pufrem (QIAGEN, Germantown, MD). Lyzáty dále připravené pro extrakci celkové RNA pomocí mini sady RNeasy (QIAGEN, Germantown, MD) podle pokynů výrobce. Extrakt RNA skladován při -80ºC až do budoucího použití. Čistota, výtěžek a koncentrace RNA budou stanoveny pomocí duální spektrofotometrie (Beckman, USA) a 1 μg RNA na 1% agarózovém gelu (Roche, Castle Hill, Austrálie), aby se zajistila integrita RNA. Kvantitativní RT-PCR (qRT-PCR): Reakční směs reverzní transkriptázy (RT) s použitím sady High Capacity Reverse Transcriptase (Applied Biosystems, USA) obsahující: 1 μg celkové RNA z každého vzorku pro syntézu cDNA, 0,5 μg náhodného primeru, 5×RT pufr, 2,5 mmol/l dNTP, 20 U inhibitoru RNázy a 200 U MMLV reverzní transkriptázy v celkovém objemu 25 μl bylo inkubováno při 37 °C po dobu 60 minut, poté zahřáto na 95 °C po dobu 5 minut pro inaktivaci MMLV. Po RT bude následovat qPCR, 50 ng cDNA bylo přidáno do 5X Fast-Start SYBR zelené hlavní směsi s Rox (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) a 200 ng směsi primerů (Sigma). Reakce bude provedena na mikrooptických destičkách (Applied Biosystems) a analyzována pomocí systému StepOne real-time 203 PCR (Applied Biosystems). Postup PCR byl následující: 10 minut při 95 °C pro aktivaci enzymu následovaných 40 cykly 15 sekund při 95 °C, 20 sekund při 55 °C a 30 sekund při 72 °C pro krok amplifikace. Primery použité při hodnocení qRT-PCR specifické pro cílové geny (tabulka 1). Relativní exprese mRNA bude vypočítána metodou komparativního prahu cyklu. jak je uvedeno v uživatelské příručce výrobce s GAPDH house-keeping genem. Fluorescence byla vynesena proti počtu PCR cyklů pro reakci a každý vzorek byl označen. Test hormonálních hladin v séru: FSH, LH a E2 byly odhadnuty pomocí ELISA podle pokynů výrobců. Purifikace a sekvenační analýza DNA: Geny IL-11 a LIF analyzovány přímým sekvenováním produktů PCR pomocí soupravy SEQr. (Applied Biosystems), podle protokolu výrobce. Produkty PCR budou purifikovány pomocí soupravy QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). Relevantní purifikované vzorky DNA všech případů a kontrol budou amplifikovány a sekvenovány pomocí automatického sekvenování s pomocí Big Dye Terminator Sequencing Kit (PE/Applied Biosystems, Foster City, CA). Vzorky budou probíhat v automatickém sekvenátoru ABI Prism 310 Avant (PE/Applied Biosystems). Všechny vzorky budou sekvenovány dvakrát, aby byly zajištěny výsledky.

Statistická analýza: Data budou statisticky popsána z hlediska střední směrodatné odchylky, mediánu a rozmezí. Srovnání mezi ženami, které mohly dosáhnout těhotenství, a těmi, které ne, bylo provedeno pomocí Mann Whitney U testu pro nezávislé vzorky. Korelace mezi různými proměnnými byla provedena pomocí Spearmanovy rovnice pořadové korelace pro nenormální proměnné.