Pilotstudie zur molekularen Quantifizierung und Sequenzierung der Genexpression endometrialer Zytokine und deren Auswirkung auf das Ergebnis des In-vitro-Fertilisationszyklus (IVF).

Die Studie wird durchgeführt

in der IVE-Einheit Kairo; Medizinische Fakultät der Universität Kairo in 15 Fällen. Einschlusskriterien: Alter 23–35, FSH unter 10, keine früheren Uterusoperationen, kein schlechtes Ansprechen bei früherer IVF in der Vorgeschichte, kein schwerer männlicher Faktor, keine Endometriose und Uterusfaktor sind ausgeschlossen. Kein Diabetes mellitus und Antralfollikelzahl (AFC) > 5 bei IVF unter Verwendung des Standard-Langprotokolls.

Alle Patienten geben ihr Einverständnis zur Teilnahme an der Studie. Endometriumgewebeproben werden am Tag der Eizellentnahme mit einem weichen Kunststoffkatheter mit Saugwirkung entnommen. Als Kontrollproben wurde das Menstruationsblut von 10 Frauen mit regelmäßigen Menstruationszyklen und ohne erkennbare endometriale Dysfunktion entnommen. Das Studienprotokoll und die Einverständniserklärungen wurden von der Humanethikkommission der IVF-Abteilung genehmigt Kasar Ini Krankenhaus

Vollständige RNA-Isolierung: Endometriumbiopsien und Menstruationskontrollblut werden durch RLT-Puffer (QIAGEN, Germantown, MD) lysiert. Die Lysate wurden mit dem RNeasy Mini-Kit (QIAGEN, Germantown, MD) gemäß den Anweisungen des Herstellers weiter für die Gesamt-RNA-Extraktion vorbereitet. Der RNA-Extrakt wird bis zur späteren Verwendung bei -80 °C gelagert. Reinheit, Ausbeute und Konzentration der RNA werden durch duale Spektrophotometrie (Beckman, USA) bestimmt und 1 μg RNA auf einem 1 %igen Agarosegel (Roche, Castle Hill, Australien) laufen gelassen, um die Integrität der RNA sicherzustellen. Quantitative RT-PCR (qRT-PCR): Reverse Transkriptase (RT)-Reaktionsmischung unter Verwendung eines High Capacity Reverse Transcriptase Kit (Applied Biosystems, USA), enthaltend: 1 μg Gesamt-RNA aus jeder Probe für die cDNA-Synthese, 0,5 μg Zufallsprimer, 5×RT Puffer, 2,5 mmol/l dNTP, 20 U RNase-Inhibitor und 200 U MMLV-Reverse-Transkriptase in einem Gesamtvolumen von 25 μl wurden 60 Minuten lang bei 37 °C inkubiert und dann 5 Minuten lang auf 95 °C erhitzt, um MMLV zu inaktivieren. Auf RT folgt qPCR, 50 ng cDNA wurden zu 5 x Fast-Start SYBR Green Master Mix mit Rox (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) und 200 ng Primermix (Sigma) hinzugefügt. Die Reaktion wird in mikrooptischen Platten (Applied Biosystems) durchgeführt und mit dem Echtzeit-PCR-System StepOne 203 (Applied Biosystems) analysiert. Die PCR-Durchführungsmethode war wie folgt: 10 Minuten bei 950 °C für die Enzymaktivierung, gefolgt von 40 Zyklen von 15 Sekunden bei 950 °C, 20 Sekunden bei 550 °C und 30 Sekunden bei 720 °C für den Amplifikationsschritt. Die in der qRT-PCR-Auswertung verwendeten Primer sind spezifisch für Zielgene (Tabelle 1). Die relative mRNA-Expression wird anhand der Vergleichszyklus-Schwellenwertmethode berechnet. wie im Benutzerhandbuch des Herstellers mit dem GAPDH-Haushaltsgen beschrieben. Die Fluoreszenz wurde gegen die PCR-Zykluszahl für die Reaktion aufgetragen und jede Probe angegeben. Bestimmung der Serumhormonspiegel: FSH, LH und E2 wurden durch ELISA gemäß den Anweisungen des Herstellers geschätzt. DNA-Reinigung und Sequenzierungsanalyse: Analyse der IL-11- und LIF-Gene durch direkte Sequenzierung der PCR-Produkte mit dem SEQr-Kit. (Applied Biosystems), gemäß Herstellerprotokoll. PCR-Produkte werden mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) gereinigt. Die relevanten gereinigten DNA-Proben aller Fälle und Kontrollen werden mittels automatisierter Sequenzierung mit Hilfe eines Big Dye Terminator Sequencing Kit (PE/Applied Biosystems, Foster City, CA) amplifiziert und sequenziert. Die Proben werden in einem automatisierten Sequenzierer ABI Prism 310 Avant (PE/Applied Biosystems) analysiert. Alle Proben werden zweimal sequenziert, um die Ergebnisse sicherzustellen.

Statistische Analyse: Die Daten werden statistisch anhand der mittleren Standardabweichung, des Medians und des Bereichs beschrieben. Der Vergleich zwischen Frauen, die eine Schwangerschaft erreichen konnten, und solchen, bei denen dies nicht der Fall war, wurde mithilfe des Mann-Whitney-U-Tests für unabhängige Stichproben durchgeführt. Die Korrelation zwischen verschiedenen Variablen wurde mithilfe der Spearman-Rangkorrelationsgleichung für nicht normale Variablen durchgeführt.