Pilotstudie på molekylær kvantifisering og sekvensering av endometrielle cytokiners genuttrykk og deres effekt på utfallet av in vitro fertilisering (IVF) syklus

Studien vil bli utført

i Kairo IVE-enheten; Det medisinske fakultet Cairo University på 15 saker. Inklusjonskriterier: alder 23 -35, FSH mindre enn 10 ingen tidligere livmoroperasjoner, ingen historie med dårlig respons ved tidligere IVF ingen alvorlig mannlig faktor ingen endometriose og livmorfaktor er ekskludert. ingen diabetes mellitus og antral follicle count (AFC) > 5 som gjennomgår IVF ved bruk av standard lang protokoll.

Alle pasienter vil gi sitt informerte samtykke til å delta i studien. Endometrievevsprøver vil bli tatt på dagen for oocyttuthenting ved bruk av mykt sugeplastkateter. Menstruasjonsblodet fra 10 kvinner med regelmessige menstruasjonssykluser og uten tilsynelatende endometriedysfunksjon ble tatt som kontrollprøver. Studieprotokollen og informerte samtykker ble godkjent av Human Ethics Committee ved IVF-avdelingen Kasar Ini sykehus

Total RNA-isolering: Endometriebiopsier og menstruasjonskontrollblod vil bli lysert av RLT-buffer (QIAGEN, Germantown, MD). Lysatene preparerte videre for total RNA-ekstraksjon ved å bruke RNeasy-minisettet (QIAGEN, Germantown, MD) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA-ekstraktet lagret ved -80ºC til fremtidig bruk. RNA-renhet, utbytte og konsentrasjon vil bli bestemt gjennom dobbel spektrofotometri (Beckman, USA), og 1μg RNA kjøres på en 1% agarosegel (Roche, Castle Hill, Australia) for å sikre integriteten til RNA. Kvantitativ RT-PCR (qRT-PCR): Revers transkriptase (RT) reaksjonsblanding ved bruk av High Capacity Reverse Transcriptase-sett (Applied Biosystems, USA) som inneholder: 1 μg totalt RNA fra hver prøve for cDNA-syntese, 0,5 μg tilfeldig primer, 5×RT buffer, 2,5 mmol/L dNTP, 20 U RNase-hemmer og 200 U MMLV revers transkriptase i et totalt volum på 25 μl ble inkubert ved 37 ºC i 60 minutter, deretter oppvarmet til 95 ºC i 5 minutter for å inaktivere MMLV. RT vil bli fulgt av qPCR, 50 ng cDNA ble tilsatt 5 X Fast-Start SYBR grønn masterblanding med Rox (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) og 200 ng primerblanding (Sigma). Reaksjonen vil bli utført i mikrooptiske plater (Applied Biosystems) og analysert ved hjelp av StepOne sanntids 203 PCR-system (Applied Biosystems). PCR-kjøringsmetoden var som følger: 10 minutter ved 950C for enzymaktivering etterfulgt av 40 sykluser på 15 sekunder ved 950C, 20 sekunder ved 550C og 30 sekunder ved 720C for amplifikasjonstrinnet. Primerne som ble brukt i qRT-PCR-evalueringen spesifikke for målgener (tabell 1). Relativt mRNA-uttrykk vil bli beregnet ved hjelp av den komparative syklusterskelmetoden. som skissert i produsentens brukerhåndbok med GAPDH house-keeping genet. Fluorescensen ble plottet mot PCR-syklusnummer for reaksjon og hver prøve ble indikert. Analyse av serumhormonnivåer: FSH, LH og E2 ble estimert ved ELISA i henhold til instruksjoner fra produsenter. DNA-rensing og sekvenseringsanalyse: IL-11- og LIF-gener analysert ved direkte sekvensering av PCR-produktene ved bruk av SEQr-sett. (Applied Biosystems), i henhold til produsentens protokoll. PCR-produkter vil bli renset ved hjelp av QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). De relevante rensede DNA-prøvene fra alle tilfellene og kontrollene vil bli amplifisert og sekvensert ved hjelp av automatisert sekvensering ved hjelp av et Big Dye Terminator Sequencing Kit (PE/Applied Biosystems, Foster City, CA). Prøvene kjøres i en automatisert sequencer ABI Prism 310 Avant (PE/Applied Biosystems). Alle prøver vil bli sekvensert to ganger for å sikre resultatene.

Statistisk analyse: Data vil bli statistisk beskrevet i form av gjennomsnittlig standardavvik, median og rekkevidde. Sammenligning mellom kvinner som kunne oppnå graviditet og de som ikke gjorde det ble gjort ved å bruke Mann Whitney U-test for uavhengige prøver. Korrelasjon mellom ulike variabler ble gjort ved å bruke Spearman rangkorrelasjonsligning for ikke-normale variabler.