Kísérleti tanulmány az endometrium citokinek génexpressziójának molekuláris mennyiségi meghatározásáról és szekvenálásáról, valamint hatásuk az in vitro megtermékenyítési (IVF) ciklus kimenetelére

A vizsgálat elvégzésre kerül

a kairói IVE egységben; A Kairói Egyetem Orvostudományi Kara 15 esetben. Bevételi kritériumok: életkor 23-35, FSH kevesebb mint 10, nincs korábbi méhműtét, nincs a kórelőzményében rossz válasz a korábbi IVF-re, nincs súlyos férfi faktor, nincs kizárva az endometriózis és a méh faktor. nincs diabetes mellitus, és az antrális tüszőszám (AFC) > 5 IVF-en, standard hosszú protokoll szerint.

Minden beteg beleegyezését adja a vizsgálatban való részvételhez. Az endometriális szövetmintákat a petesejtek levételének napján, lágy szívású műanyag katéter segítségével veszik. Kontrollmintaként 10 rendszeres menstruációs ciklusú, nyilvánvaló endometriális diszfunkciót nem szenvedő nő menstruációs vérét vettük. A vizsgálati protokollt és a beleegyezéseket az IVF osztály Humán Etikai Bizottsága hagyta jóvá Kasar Ini kórház

Teljes RNS izolálás: Az endometriális biopsziákat és a menstruációs kontroll vért RLT pufferrel lizálják (QIAGEN, Germantown, MD). A lizátumokat az RNeasy mini kittel (QIAGEN, Germantown, MD) a gyártó utasításai szerint tovább készítettük a teljes RNS extrakcióhoz. Az RNS-kivonatot -80ºC-on tároltuk a későbbi felhasználásig. Az RNS tisztaságát, hozamát és koncentrációját kettős spektrofotometriával határozzuk meg (Beckman, USA), és 1 μg RNS-t 1%-os agaróz gélen (Roche, Castle Hill, Ausztrália) futtatunk, hogy biztosítsuk az RNS integritását. Kvantitatív RT-PCR (qRT-PCR): Reverz transzkriptáz (RT) reakcióelegy High Capacity Reverse Transcriptase készlettel (Applied Biosystems, USA), amely a következőket tartalmazza: 1 μg teljes RNS minden mintából cDNS szintézishez, 0,5 μg random primer, 5×RT puffert, 2,5 mmol/L dNTP-t, 20 U RNáz inhibitort és 200 U MMLV reverz transzkriptázt 25 μl össztérfogatban 37 ºC-on 60 percig inkubáltunk, majd 5 percig 95 ºC-ra melegítettük az MMLV inaktiválására. Az RT-t qPCR követi, 50 ng cDNS-t adtunk az 5X Fast-Start SYBR zöld mesterkeverékhez Rox-szal (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) és 200 ng primer keverékhez (Sigma). A reakciót mikrooptikai lemezeken (Applied Biosystems) hajtják végre, és StepOne valós idejű 203 PCR rendszerrel (Applied Biosystems) elemzik. A PCR futtatási módszer a következő volt: 10 perc 950 °C-on az enzimaktiváláshoz, majd 40 ciklus 15 másodpercig 95 °C-on, 20 másodperc 55 °C-on és 30 másodperc 720 °C-on az amplifikációs lépéshez. A qRT-PCR kiértékelésben használt primerek a célgénekre specifikusak (1. táblázat). A relatív mRNS expressziót az összehasonlító ciklusküszöb módszerrel számítjuk ki. a gyártó felhasználói kézikönyvében leírtak szerint a GAPDH house-keeping génnel. A fluoreszcenciát a reakció PCR ciklusszáma függvényében ábrázoltuk, és minden mintát feltüntettünk. A szérum hormonszintek vizsgálata: Az FSH, LH és E2 becslése ELISA-val történt a gyártók utasításai szerint. DNS tisztítás és szekvenálás analízis: Az IL-11 és LIF gének elemzése a PCR termékek közvetlen szekvenálásával SEQr kit segítségével. (Applied Biosystems), a gyártó protokollja szerint. A PCR-termékek tisztítása a QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) segítségével történik. Az összes eset és kontroll megfelelő tisztított DNS-mintáját amplifikálják és szekvenálják automatizált szekvenálás segítségével egy Big Dye Terminator Sequencing Kit (PE/Applied Biosystems, Foster City, CA) segítségével. A mintákat egy automatizált ABI Prism 310 Avant (PE/Applied Biosystems) szekvenálóban futtatjuk. Az eredmények biztosítása érdekében minden mintát kétszer szekvenálnak.

Statisztikai elemzés: Az adatokat statisztikailag az átlagos szórás, a medián és a tartomány szerint írjuk le. A független mintákhoz Mann Whitney U-teszttel hasonlították össze azokat a nőket, akiknél sikerült teherbe esni, és azokat, akik nem. A különböző változók közötti korrelációt Spearman rangkorrelációs egyenlet segítségével végeztük nem normál változókra.