Пилотное исследование молекулярного количественного анализа и секвенирования экспрессии генов эндометриальных цитокинов и их влияния на исход цикла экстракорпорального оплодотворения (ЭКО)

Исследование будет проводиться

в Каирском отделении IVE; Медицинский факультет Каирского университета на 15 корпусов. Критерии включения: возраст 23–35 лет, уровень ФСГ менее 10, отсутствие операций на матке в анамнезе, отсутствие в анамнезе плохого ответа на предыдущие ЭКО, отсутствие тяжелого мужского фактора, отсутствие эндометриоза и маточного фактора. отсутствие сахарного диабета и количества антральных фолликулов (AFC)> 5, подвергающихся ЭКО с использованием стандартного длинного протокола.

Все пациенты дадут информированное согласие на участие в исследовании. Образцы ткани эндометрия будут взяты в день извлечения ооцитов с помощью пластикового катетера с мягким всасыванием. В качестве контрольных образцов была взята менструальная кровь 10 женщин с регулярным менструальным циклом и без выраженной дисфункции эндометрия. Протокол исследования и информированное согласие были одобрены Комитетом по этике человека отделения ЭКО. Госпиталь Касар Ини

Выделение тотальной РНК: биоптаты эндометрия и контрольная кровь менструального цикла будут лизироваться буфером RLT (QIAGEN, Germantown, MD). Лизаты дополнительно готовили для выделения тотальной РНК с использованием мини-набора RNeasy (QIAGEN, Germantown, MD) в соответствии с инструкциями производителя. Экстракт РНК хранят при температуре -80ºC до использования в будущем. Чистота, выход и концентрация РНК будут определяться с помощью двойной спектрофотометрии (Beckman, США) и 1 мкг РНК на 1% агарозном геле (Roche, Castle Hill, Австралия) для обеспечения целостности РНК. Количественная RT-PCR (qRT-PCR): реакционная смесь для обратной транскриптазы (RT) с использованием набора High Capacity Reverse Transcriptase (Applied Biosystems, США), содержащего: 1 мкг тотальной РНК из каждого образца для синтеза кДНК, 0,5 мкг случайного праймера, 5×RT буфер, 2,5 ммоль/л дНТФ, 20 ЕД ингибитора РНКазы и 200 ЕД обратной транскриптазы MMLV в общем объеме 25 мкл инкубировали при 37°С в течение 60 минут, затем нагревали до 95°С в течение 5 минут для инактивации MMLV. За RT последует количественная ПЦР, 50 нг кДНК добавляют к 5 X зеленой мастер-миксе Fast-Start SYBR с Rox (Roche Diagnostics, Индианаполис, Индиана) и 200 нг смеси праймеров (Sigma). Реакцию проводят в микрооптических планшетах (Applied Biosystems) и анализируют с использованием системы ПЦР в реальном времени StepOne 203 (Applied Biosystems). Метод проведения ПЦР был следующим: 10 минут при 95°С для активации фермента, затем 40 циклов по 15 секунд при 95°С, 20 секунд при 55°С и 30 секунд при 72°С для стадии амплификации. Праймеры, использованные в qRT-PCR, специфичны для генов-мишеней (таблица 1). Относительная экспрессия мРНК будет рассчитываться методом порога сравнительного цикла. как указано в руководстве пользователя производителя с геном домашнего хозяйства GAPDH. Флуоресценцию наносили на график в зависимости от количества циклов ПЦР для реакции и указывали каждый образец. Анализ уровня гормонов в сыворотке: ФСГ, ЛГ и Е2 определяли с помощью ИФА в соответствии с инструкциями производителей. Очистка ДНК и анализ секвенирования: гены IL-11 и LIF анализировали путем прямого секвенирования продуктов ПЦР с использованием набора SEQr. (Applied Biosystems), согласно протоколу производителя. Продукты ПЦР будут очищены с использованием набора для экстракции из геля QIAquick (QIAGEN). Соответствующие очищенные образцы ДНК всех случаев и контролей будут амплифицированы и секвенированы с использованием автоматического секвенирования с помощью набора для секвенирования Big Dye Terminator Sequencing Kit (PE/Applied Biosystems, Foster City, CA). Образцы будут запускаться в автоматизированном секвенаторе ABI Prism 310 Avant (PE/Applied Biosystems). Все образцы будут секвенированы дважды, чтобы гарантировать результаты.

Статистический анализ: данные будут статистически описаны с точки зрения среднего стандартного отклонения, медианы и диапазона. Сравнение между женщинами, которые могли забеременеть, и теми, кто не смог, было проведено с использованием U-критерия Манна-Уитни для независимых выборок. Корреляция между различными переменными была сделана с использованием уравнения ранговой корреляции Спирмена для ненормальных переменных.