子宮内膜サイトカイン遺伝子発現の分子定量と配列決定、および体外受精（IVF）周期の結果に対するそれらの影響に関するパイロット研究

研究が行われます

カイロIVEユニット内。カイロ大学医学部 15 件。 対象基準：23～35歳、FSHが10未満、子宮手術歴なし、体外受精で反応不良歴なし、重度の男性因子なし、子宮内膜症なし、子宮因子は除外される。 糖尿病がなく、胞状卵胞数（AFC）が5以上で、標準的な長期プロトコールを使用して体外受精を受けている。

すべての患者は研究に参加するためにインフォームドコンセントを与えます。 子宮内膜組織サンプルは、採卵日に軟吸引プラスチックカテーテルを使用して採取されます。 規則的な月経周期を持ち、明らかな子宮内膜機能不全のない 10 人の女性の月経血を対照サンプルとして採取しました。 研究プロトコールとインフォームドコンセントは、体外受精部門の人間倫理委員会によって承認されました。 カサル・イニ病院

全ＲＮＡ単離：子宮内膜生検および月経対照血液は、ＲＬＴ緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ、メリーランド州ジャーマンタウン）によって溶解される。 ライセートはさらに、RNeasy ミニキット (QIAGEN、メリーランド州ジャーマンタウン) を製造業者の指示に従って使用して、全 RNA 抽出用に調製されました。 RNA 抽出物は、将来使用するまで -80°C で保管されました。 RNA の純度、収量、および濃度はデュアル分光測光法 (Beckman、米国) によって決定され、1 μg の RNA を 1% アガロースゲル (Roche、キャッスルヒル、オーストラリア) 上で泳動して RNA の完全性を確認します。 定量的 RT-PCR (qRT-PCR): High Capacity Reverse Transcriptase キット (Applied Biosystems、米国) を使用した逆転写酵素 (RT) 反応混合物。これには、cDNA 合成用の各サンプルからの 1 μg の全 RNA、0.5 μg のランダム プライマー、5 × RT が含まれます。緩衝液、2.5 mmol/L dNTP、20 U RNase インヒビター、および 200 U MMLV 逆転写酵素を総量 25 μl で混合し、37 °C で 60 分間インキュベートし、その後 95 °C で 5 分間加熱して MMLV を不活化しました。 RT に続いて qPCR を行い、50 ng の cDNA を、Rox (Roche Diagnostics、インディアナ州インディアナポリス) および 200 ng のプライマー ミックス (Sigma) を含む 5 X Fast-Start SYBR グリーン マスター ミックスに添加しました。 反応はマイクロ光学プレート (Applied Biosystems) で実行され、StepOne リアルタイム 203 PCR システム (Applied Biosystems) を使用して分析されます。 ＰＣＲ実行方法は以下の通りであった：酵素活性化のために９５℃で１０分間、その後増幅ステップとして９５℃で１５秒間、５５℃で２０秒間および７２℃で３０秒間の４０サイクル。 qRT-PCR 評価で使用した標的遺伝子に特異的なプライマー (表 1)。 相対的な mRNA 発現は、比較サイクル閾値法によって計算されます。 GAPDH ハウスキーピング遺伝子についてはメーカーのユーザーマニュアルに概要が記載されています。 反応および各サンプルについて、蛍光を PCR サイクル数に対してプロットしました。 血清ホルモンレベルアッセイ: FSH、LH、および E2 は、製造業者の指示に従って ELISA によって推定されました。 DNA精製および配列決定分析: SEQrキットを使用したPCR産物の直接配列決定によってIL-11およびLIF遺伝子を分析しました。 (Applied Biosystems)、製造業者のプロトコルに従って。 PCR産物は、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)を使用して精製されます。 すべての症例および対照の関連する精製 DNA サンプルは、Big Dye Terminator Sequencing Kit (PE/Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ) を利用した自動配列決定を使用して増幅および配列決定されます。 サンプルは自動シーケンサー ABI Prism 310 Avant (PE/Applied Biosystems) で実行されます。 結果を確実にするために、すべてのサンプルは 2 回シーケンスされます。

統計分析: データは、平均標準偏差、中央値、および範囲の観点から統計的に記述されます。 妊娠できた女性と妊娠できなかった女性の比較は、独立したサンプルに対してマン ホイットニー U テストを使用して行われました。 さまざまな変数間の相関は、非正規変数に対する Spearman 順位相関式を使用して行われました。