Studio pilota sulla quantificazione molecolare e il sequenziamento dell'espressione genica delle citochine endometriali e il loro effetto sull'esito del ciclo di fecondazione in vitro (IVF)

Lo studio sarà eseguito

nell'Unità IVE del Cairo; Facoltà di medicina Università del Cairo su 15 casi. Criteri di inclusione: età 23-35 anni, FSH inferiore a 10 nessun precedente intervento uterino, nessuna storia di scarsa risposta nella precedente fecondazione in vitro nessun fattore maschile grave nessuna endometriosi e fattore uterino sono esclusi. nessun diabete mellito e conta dei follicoli antrali (AFC) > 5 sottoposti a fecondazione in vitro utilizzando il protocollo lungo standard.

Tutti i pazienti daranno il loro consenso informato a partecipare allo studio. I campioni di tessuto endometriale verranno prelevati il ​​giorno del prelievo degli ovociti utilizzando un catetere di plastica ad aspirazione morbida. Il sangue mestruale di 10 donne con cicli mestruali regolari e senza apparente disfunzione endometriale è stato prelevato come campione di controllo. Il protocollo dello studio ei consensi informati sono stati approvati dal Comitato Etico Umano del dipartimento IVF .of Ospedale Kasar Ini

Isolamento totale dell'RNA: biopsie endometriali e sangue di controllo mestruale saranno lisati mediante tampone RLT (QIAGEN, Germantown, MD). I lisati sono stati ulteriormente preparati per l'estrazione dell'RNA totale utilizzando il mini kit RNeasy (QIAGEN, Germantown, MD) secondo le istruzioni del produttore. L'estratto di RNA conservato a -80ºC fino al futuro utilizzo. La purezza, la resa e la concentrazione dell'RNA saranno determinate mediante doppia spettrofotometria (Beckman, USA) e 1μg di RNA verrà eseguito su un gel di agarosio all'1% (Roche, Castle Hill, Australia) per garantire l'integrità dell'RNA. RT-PCR quantitativa (qRT-PCR): miscela di reazione della trascrittasi inversa (RT) utilizzando il kit della trascrittasi inversa ad alta capacità (Applied Biosystems, USA) contenente: 1 μg di RNA totale da ciascun campione per la sintesi di cDNA, 0,5 μg di primer random, 5×RT tampone, 2,5 mmol/L dNTP, 20 U RNasi inibitore e 200 U MMLV trascrittasi inversa in un volume totale di 25 μl è stato incubato a 37°C per 60 minuti, quindi riscaldato a 95°C per 5 minuti per inattivare MMLV. La RT sarà seguita da qPCR, 50 ng di cDNA sono stati aggiunti a 5 X Fast-Start SYBR green master mix con Rox (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) e 200 ng di primer mix (Sigma). La reazione sarà condotta in micropiastre ottiche (Applied Biosystems) e analizzata utilizzando il sistema StepOne real-time 203 PCR (Applied Biosystems). Il metodo di esecuzione della PCR era il seguente: 10 minuti a 950°C per l'attivazione dell'enzima seguiti da 40 cicli di 15 secondi a 950°C, 20 secondi a 550°C e 30 secondi a 720°C per la fase di amplificazione. I primer utilizzati nella valutazione qRT-PCR specifici per i geni bersaglio (tabella 1). L'espressione relativa dell'mRNA sarà calcolata con il metodo della soglia del ciclo comparativo. come indicato nel manuale utente del produttore con il gene domestico GAPDH. La fluorescenza è stata tracciata rispetto al numero di cicli PCR per la reazione e ogni campione è stato indicato. Dosaggio dei livelli ormonali sierici: FSH, LH ed E2 sono stati stimati mediante ELISA secondo le istruzioni dei produttori. Analisi di purificazione e sequenziamento del DNA: geni IL-11 e LIF analizzati mediante sequenziamento diretto dei prodotti di PCR utilizzando il kit SEQr. (Applied Biosystems), secondo protocollo del produttore. I prodotti di PCR saranno purificati utilizzando il QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). I relativi campioni di DNA purificato di tutti i casi e controlli saranno amplificati e sequenziati utilizzando il sequenziamento automatizzato con l'ausilio di un Big Dye Terminator Sequencing Kit (PE/Applied Biosystems, Foster City, CA). I campioni verranno analizzati in un sequenziatore automatico ABI Prism 310 Avant (PE/Applied Biosystems).. Tutti i campioni saranno sequenziati due volte per garantire i risultati.

Analisi statistica: i dati saranno descritti statisticamente in termini di deviazione standard media, mediana e intervallo. Il confronto tra le donne che potevano raggiungere una gravidanza e quelle che non l'hanno fatto è stato fatto utilizzando il test U di Mann Whitney per campioni indipendenti. La correlazione tra le varie variabili è stata effettuata utilizzando l'equazione di correlazione del rango di Spearman per le variabili non normali.