Pilotstudie om molekylär kvantifiering och sekvensering av endometriella cytokiners genuttryck och deras effekt på resultatet av in vitro fertilisering (IVF) cykel

Studien kommer att genomföras

i Kairo IVE-enheten; Medicinska fakulteten Cairo University på 15 fall. Inklusionskriterier: ålder 23 -35, FSH mindre än 10 inga tidigare livmoderoperationer, ingen historia av dåligt svar vid tidigare IVF ingen allvarlig manlig faktor ingen endometrios och livmoderfaktor är uteslutna. ingen diabetes mellitus och antral follikelräkning (AFC) > 5 som genomgår IVF med standard långt protokoll.

Alla patienter kommer att ge sitt informerade samtycke till att delta i studien. Endometrievävnadsprover kommer att tas på dagen för oocythämtning med mjuk sugplastkateter. Menstruationsblodet från 10 kvinnor med regelbundna menstruationscykler och utan uppenbar endometriedysfunktion togs som kontrollprov. Studieprotokollet och informerade samtycken godkändes av Human Ethics Committee vid IVF-avdelningen Kasar Ini sjukhus

Total RNA-isolering: Endometriebiopsier och menstruationskontrollblod lyseras med RLT-buffert (QIAGEN, Germantown, MD). Lysaten preparerades vidare för total RNA-extraktion med användning av RNeasy mini-kit (QIAGEN, Germantown, MD) enligt tillverkarens instruktioner. RNA-extraktet lagrades vid -80ºC tills framtida användning. RNA-renhet, utbyte och koncentration kommer att bestämmas genom dubbel spektrofotometri (Beckman, USA), och 1 μg RNA körs på en 1% agarosgel (Roche, Castle Hill, Australien) för att säkerställa RNA:ts integritet. Kvantitativ RT-PCR (qRT-PCR): Omvänt transkriptas (RT) reaktionsblandning med High Capacity Reverse Transcriptase kit (Applied Biosystems, USA) innehållande: 1 μg totalt RNA från varje prov för cDNA-syntes, 0,5 μg slumpmässig primer, 5×RT buffert, 2,5 mmol/L dNTP, 20 U RNashämmare och 200 U MMLV omvänt transkriptas i en total volym av 25 μl inkuberades vid 37 ºC i 60 minuter, värmdes sedan till 95 ºC i 5 minuter för att inaktivera MMLV. RT kommer att följas av qPCR, 50 ng cDNA tillsattes till 5 X Fast-Start SYBR grön mastermix med Rox (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) och 200 ng primermix (Sigma). Reaktionen kommer att utföras i mikrooptiska plattor (Applied Biosystems) och analyseras med hjälp av StepOne realtid 203 PCR-system (Applied Biosystems). PCR-körningsmetoden var som följer: 10 minuter vid 950C för enzymaktivering följt av 40 cykler på 15 sekunder vid 950C, 20 sekunder vid 550C och 30 sekunder vid 720C för amplifieringssteget. De primrar som används i QRT-PCR-utvärderingen specifika för målgener (tabell 1). Relativt mRNA-uttryck kommer att beräknas med den jämförande cykeltröskelmetoden. som beskrivs i tillverkarens användarmanual med GAPDH house-keeping gen. Fluorescensen plottades mot PCR-cykelnummer för reaktion och varje prov indikerade. Analys av hormonnivåer i serum: FSH, LH och E2 uppskattades med ELISA enligt tillverkarens instruktioner. DNA-rening och sekvenseringsanalys: IL-11- och LIF-gener analyserade genom direkt sekvensering av PCR-produkterna med användning av SEQr-kit. (Applied Biosystems), enligt tillverkarens protokoll. PCR-produkter kommer att renas med QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). De relevanta renade DNA-proverna från alla fall och kontroller kommer att amplifieras och sekvenseras med hjälp av automatiserad sekvensering med hjälp av ett Big Dye Terminator Sequencing Kit (PE/Applied Biosystems, Foster City, CA). Proverna kommer att köras i en automatiserad sequencer ABI Prism 310 Avant (PE/Applied Biosystems). Alla prover kommer att sekvenseras två gånger för att säkerställa resultaten.

Statistisk analys: Data kommer att beskrivas statistiskt i termer av genomsnittlig standardavvikelse, median och intervall. Jämförelse mellan kvinnor som kunde uppnå graviditet och de som inte gjorde det gjordes med Mann Whitney U-test för oberoende prover. Korrelation mellan olika variabler gjordes med hjälp av Spearmans rangkorrelationsekvation för icke-normala variabler.