Pilotundersøgelse om molekylær kvantificering og sekventering af endometrielle cytokiners genekspression og deres effekt på resultatet af in vitro fertiliseringscyklus (IVF)

Undersøgelsen vil blive udført

i Cairo IVE-enheden; Det medicinske fakultet Cairo University på 15 sager. Inklusionskriterier: alder 23-35, FSH mindre end 10 ingen tidligere livmoderoperationer, ingen historie med dårlig respons i tidligere IVF ingen alvorlig mandlig faktor ingen endometriose og uterin faktor er udelukket. ingen diabetes mellitus og antral follikeltal (AFC) > 5 undergår IVF ved brug af standard lang protokol.

Alle patienter vil give deres informerede samtykke til at deltage i undersøgelsen. Endometrievævsprøver vil blive taget på dagen for oocytudtagning ved hjælp af blødt sugeplastikkateter. Menstruationsblodet fra 10 kvinder med regelmæssige menstruationscyklusser og uden tilsyneladende endometriedysfunktion blev taget som kontrolprøver. Undersøgelsesprotokollen og informerede samtykker blev godkendt af Human Ethics Committee af IVF-afdelingen Kasar Ini hospital

Total RNA-isolering: Endometriebiopsier og menstruationskontrolblod vil blive lyseret af RLT-buffer (QIAGEN, Germantown, MD). Lysaterne blev yderligere forberedt til total RNA-ekstraktion ved hjælp af RNeasy mini-kittet (QIAGEN, Germantown, MD) i henhold til producentens instruktioner. RNA-ekstraktet opbevares ved -80ºC indtil fremtidig brug. RNA-renhed, udbytte og koncentration vil blive bestemt gennem dobbelt spektrofotometri (Beckman, USA), og 1 μg RNA køres på en 1% agarosegel (Roche, Castle Hill, Australien) for at sikre integriteten af ​​RNA'et. Kvantitativ RT-PCR (qRT-PCR): Revers transkriptase (RT) reaktionsblanding ved hjælp af High Capacity Reverse Transcriptase kit (Applied Biosystems, USA) indeholdende: 1 μg total RNA fra hver prøve til cDNA-syntese, 0,5 μg tilfældig primer, 5×RT buffer, 2,5 mmol/L dNTP, 20 U RNase-hæmmer og 200 U MMLV revers transkriptase i et samlet volumen på 25 μl blev inkuberet ved 37 ºC i 60 minutter, derefter opvarmet til 95 ºC i 5 minutter for at inaktivere MMLV. RT vil blive efterfulgt af qPCR, 50 ng cDNA blev tilsat til 5 X Fast-Start SYBR green master mix med Rox (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) og 200 ng primer mix (Sigma). Reaktionen vil blive udført i mikrooptiske plader (Applied Biosystems) og analyseret ved hjælp af StepOne real-time 203 PCR system (Applied Biosystems). PCR-kørselsmetoden var som følger: 10 minutter ved 95°C til enzymaktivering efterfulgt af 40 cyklusser af 15 sekunder ved 95°C, 20 sekunder ved 550°C og 30 sekunder ved 720°C til amplifikationstrinnet. De primere, der anvendes i qRT-PCR-evalueringen, er specifikke for målgener (tabel 1). Relativ mRNA-ekspression vil blive beregnet ved den sammenlignende cyklus-tærskelmetode. som beskrevet i producentens brugermanual med GAPDH husholdningsgen. Fluorescensen blev plottet i forhold til PCR-cyklusnummer for reaktion, og hver prøve blev angivet. Assay for hormonniveauer i serum: FSH, LH og E2 blev estimeret ved ELISA i henhold til instruktionerne fra producenterne. DNA-oprensning og sekventeringsanalyse: IL-11- og LIF-gener analyseret ved direkte sekventering af PCR-produkterne ved hjælp af SEQr-kit. (Applied Biosystems), i henhold til producentens protokol. PCR-produkter vil blive oprenset ved hjælp af QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). De relevante oprensede DNA-prøver af alle tilfældene og kontrollerne vil blive amplificeret og sekventeret ved hjælp af automatiseret sekventering ved hjælp af et Big Dye Terminator Sequencing Kit (PE/Applied Biosystems, Foster City, CA). Prøverne vil blive kørt i en automatiseret sequencer ABI Prism 310 Avant (PE/Applied Biosystems). Alle prøver vil blive sekventeret to gange for at sikre resultaterne.

Statistisk analyse: Data vil blive statistisk beskrevet i form af gennemsnitlig standardafvigelse, median og rækkevidde. Sammenligning mellem kvinder, der kunne opnå graviditet, og dem, der ikke gjorde, blev foretaget ved hjælp af Mann Whitney U-test for uafhængige prøver. Korrelation mellem forskellige variable blev udført ved hjælp af Spearman rangkorrelationsligning for ikke-normale variable.