慢性移植物抗宿主病 (GVHD) 患者的供体调节性 T 细胞输注

治疗计划

1 免疫抑制药物（DTI 和控制臂）

• Rapa 将在纳入后 2 周内开始。 Rapa 将以 2-6 毫克负荷剂量给药一天，然后每天约 1 毫克，以达到 5 至 10 纳克/毫升的目标谷水平。 波谷水平测量的频率将根据研究者的选择进行；
• 如果慢性 GVHD 解决 ≥ 3 个月或出现无法控制的副作用或慢性 GVHD 进展，则可以停用 Rapa。
• rapa 启动后 2 周内停用钙调神经磷酸酶抑制剂。 没有对免疫抑制药物进行其他修改，特别是没有减少类固醇的剂量（除非是副作用所必需的）。

• rapa 启动后 60 天慢性 GVHD 的评估。 在第 60 天 GVHD 进展的患者或 GVHD CR 的患者均不会给予 DTI。

  2. 供体淋巴细胞的收集（DTI 臂）

• 将在给患者服用 rapa 的第一天后 60-90 天对供体进行单采术。在白细胞分离术之前，供体没有特别的准备。 在书面知情同意后，捐赠者将在 1 天内接受白细胞分离术。 将使用连续流动血细胞分离器并遵循单核细胞收集方案进行白细胞去除术。 处理的血液量为 20 升。 将使用 ACD-A/肝素溶液进行抗凝。

  3. Tregselection 和输液（DTI 臂）

• 根据制造商的建议，Treg 将在列日 CHU 的 LTCG 中使用 CliniMACS 分离系统 (MiltenyiBiotec) 通过两步程序（CD8 和 CD19 耗尽，然后进行 CD25 阳性选择）从单采血液成分术产品中分离出来。 Treg 产品的等分试样 (≈ 3 mL) 将被保存用于分析。
• Treg 将在 rapa 给药第一天后和钙调神经磷酸酶抑制剂停药后 60-90 天静脉内输注。 不会在控制臂中执行 DTI。
• 低剂量 Il-2（1x106 IU/天）将在 DTI 当天开始，并将持续 2 个月，以扩大输注的供体 Treg。

患者的随访

1. 细胞制品的质量控制 1.1 外周血。

   在收集淋巴细胞的日子里，将对供体的外周血进行以下实验室分析：

   • 自动细胞计数器中的有核细胞计数和分类；

   1.1.2 白细胞去除术产品以及 Treg 选择的开始、中间和最终部分。

   以下实验室分析将在淋巴细胞收集以及 Treg 选择的开始、中间和最终部分中进行：

   • 自动细胞计数器上的有核细胞计数和分类；

   • FACS 分析确定细胞百分比（占总 WBC），标记物为：CD20-FITC (Miltenyi #130-091-110)、CD14-PE (Miltenyi #130-091-412)、CD15-PE (Miltenyi #130 -091-390)、CD56-PE (Miltenyi #130-090-910)、CD45-VioBlue (Miltenyi #130-092-497)、CD8-APC (Miltenyi #130-091-083)、碘化丙啶 (Miltenyi #130 -093-233)、T reg 检测试剂盒 (CD4/Cd25/CD127) (Miltenyi #130-096-076) 和 Treg 检测试剂盒#2 (CD4/CD25/Foxp3)-APC (Miltenyi #130-094-158 ).
   • 使用以下标记的 Treg 表型：CD127、CD45RA、CCR4、CCR7 和 KI67。
   • Treg 功能的估计42。
   • 位于 FoxP3 内含子保守区的 CpG 二核苷酸的甲基化状态
   • 通过台盼蓝排除法检测细胞活力。
   • 微生物学测试，包括标准病毒学和细菌培养。

   1.1.3发布标准。

   释放应满足以下条件：

   • ≥ 0.5 x106 个细胞/kg 接受者；

   • ≥ 55% CD4+FoxP3+；
   • 存活率 > 80%；
   • <0.05 x 106 CD45+CD8+ 细胞/kg。
2. 细胞输注的毒性将按照标准程序仔细监测与 Treg 输注相关的潜在毒性。

3. 临床资料

   将仔细观察患者并记录以下临床参数：

   • DTI 后急性GVHD 的发生率、时间和严重程度，其治疗和结果；

   • 慢性 GVHD 的演变、治疗和结果。 更具体地说，将根据修订后的 NIH 共识评估每个器官的慢性 GVHD（包括当前的免疫抑制治疗）：
   • 继发性血细胞减少症的发生率、时间和严重程度，其治疗和结果；
   • 细菌、病毒、真菌和原虫感染的发生率、时间和严重程度
   • 住院时间（如有）；
   • 原发恶性疾病的演变：纳入时未达到CR的反应、复发、治疗和结局；
   • 与移植手术相关的任何其他严重并发症；
   • 死亡与生存。
4. 免疫学数据（在 ULG 的 GIGA 中进行，除了位于 FoxP3 内含子 1 保守区域的 CpG 二核苷酸的甲基化状态分析外，将在伦敦大学学院进行）。

1) 免疫恢复 I（流式细胞术）。 将进行以下分析（从 5 mL 血液开始）。

2）免疫恢复II。 通过下一代测序（NGS；从 50 mL 血液开始）分离 T 细胞亚群以分析曲目多样性。 以下子集将被分离（每个约 50,000 个细胞），然后冷冻保存：

• CD4+ CD25+ 调节性 T 细胞（初始、激活和记忆），
• CD4+ CD25- 非调节性 T 细胞（初始/记忆），以及
• CD8+ 细胞毒性 T 细胞（初始/记忆）。