Perfusion de cellules T régulatrices du donneur chez les patients atteints de maladie chronique du greffon contre l'hôte (GVHD)

PLAN DE TRAITEMENT

1 Médicaments immunosuppresseurs (DTI et groupes témoins)

• Rapa sera démarré dans les 2 semaines suivant l'inclusion. Rapa sera administré à une dose de charge de 2 à 6 mg pendant une journée, suivie d'environ 1 mg par jour pour atteindre un niveau cible de 5 à 10 ng/mL. La fréquence des mesures du niveau du creux sera faite selon le choix de l'investigateur ;
• Rapa peut être arrêté en cas de résolution de la GVHD chronique ≥ 3 mois ou en cas d'effets secondaires ingérables ou de progression de la GVHD chronique.
• Arrêt de l'inhibiteur de la calcineurine dans les 2 semaines suivant l'initiation du rapa. Aucune autre modification des médicaments immunosuppresseurs et en particulier aucune diminution de la dose de stéroïdes (sauf si nécessaire pour des effets secondaires).

• Évaluation de la GVHD chronique 60 jours après le début du rapa. Le DTI ne sera pas administré aux patients qui ont eu une progression de leur GVHD au jour 60 ni à ceux qui sont en RC de leur GVHD.

  2. Collecte des lymphocytes du donneur (bras DTI)

• L'aphérèse du donneur sera effectuée 60 à 90 jours après le premier jour d'administration de rapa au patient. Il n'y aura pas de préparation particulière du donneur avant la leucaphérèse. Après consentement éclairé écrit, le donneur subira des leucaphérèses sur 1 jour. La leucaphérèse sera effectuée à l'aide d'un séparateur de cellules sanguines à flux continu et selon un protocole de collecte de cellules mononucléaires. Le volume de sang traité sera de 20 litres. L'anticoagulation sera réalisée avec la solution ACD-A/héparine.

  3. Tregsélection et infusion (bras DTI)

• Les Treg seront isolés au LTCG du CHU de Liège à partir du produit d'aphérèse avec le système de séparation CliniMACS (MiltenyiBiotec) suivant une procédure en deux étapes (épuisement des CD8 et CD19 suivi d'une sélection positive des CD25) selon la recommandation du fabricant. Des aliquotes (≈ 3 ml) du produit Treg seront conservées pour les analyses.
• Le Treg sera perfusé par voie intraveineuse 60 à 90 jours après le premier jour d'administration de rapa et après l'arrêt de l'inhibiteur de la calcineurine. Aucun DTI ne sera effectué dans le bras témoin.
• L'IL-2 à faible dose (1x106 UI/jour) débutera le jour de l'ITD et se poursuivra pendant une période de 2 mois afin d'étendre les Tregs du donneur infusés.

SUIVI DES PATIENTS

1. Contrôles de qualité des produits cellulaires 1.1 Sang périphérique.

   Les analyses de laboratoire suivantes seront réalisées dans le sang périphérique du donneur les jours de prélèvements lymphocytaires :

   • Comptage et différentiel des cellules nucléées dans un compteur de cellules automatisé ;

   1.1.2 Produit de leucaphérèse ainsi que fractions de départ, intermédiaires et finales de la sélection Treg.

   Les analyses de laboratoire suivantes seront effectuées dans la collection de lymphocytes ainsi que dans les fractions initiale, intermédiaire et finale de la sélection Treg :

   • Comptage et différentiel des cellules nucléées sur un compteur de cellules automatisé ;

   • Analyse FACS avec détermination du % de cellules (sur WBC total) avec les marqueurs : CD20-FITC (Miltenyi #130-091-110), CD14-PE (Miltenyi #130-091-412), CD15-PE (Miltenyi #130 -091-390), CD56-PE (Miltenyi #130-090-910), CD45-VioBlue (Miltenyi #130-092-497), CD8-APC (Miltenyi #130-091-083), PropidiumIodid (Miltenyi #130 -093-233), Kit de détection T reg (CD4/Cd25/CD127) (Miltenyi #130-096-076) et Kit de détection Treg #2 (CD4/CD25/Foxp3)-APC (Miltenyi #130-094-158 ).
   • Phénotype Treg utilisant les marqueurs suivants : CD127, CD45RA, CCR4, CCR7 et KI67.
   • Estimation de la fonction Treg42.
   • Statut de méthylation des dinucléotides CpG situés dans une région conservée de l'intron FoxP3
   • Viabilité cellulaire par exclusion du bleu trypan.
   • Tests microbiologiques, y compris virologie standard et culture bactérienne.

   1.1.3 Critères de libération.

   Les critères suivants doivent être remplis pour la libération :

   • ≥ 0,5 x106 cellules/kg receveur ;

   • ≥ 55 % CD4+FoxP3+ ;
   • Viabilité > 80% ;
   • <0,05 x 106 cellules CD45+CD8+/kg.
2. Toxicités des perfusions de cellules Les toxicités potentielles associées aux perfusions de Treg seront soigneusement surveillées conformément aux procédures standard.

3. Donnée clinique

   Le patient sera soigneusement observé et les paramètres cliniques suivants seront enregistrés :

   • Incidence, moment et gravité de la GVHD aiguë suite à une IDT, son traitement et ses résultats ;

   • Évolution de la GVHD chronique, son traitement et ses résultats. Plus précisément, la GVHD chronique (y compris le traitement immunosuppresseur actuel) sera évaluée pour chaque organe selon le consensus révisé des NIH :
   • Incidence, moment et gravité de la cytopénie secondaire, son traitement et ses résultats ;
   • Incidence, moment et gravité des infections bactériennes, virales, fongiques et protozoaires
   • Durée de l'hospitalisation le cas échéant ;
   • Évolution de la maladie maligne primitive : réponse si pas en RC au moment de l'inclusion, rechute, son traitement et évolution ;
   • Toute autre complication grave associée à la procédure de greffe ;
   • Mort et survie.
4. Données immunologiques (réalisées au GIGA à l'ULG pour tout sauf les analyses du statut de méthylation des dinucléotides CpG situés dans une région conservée de l'intron 1 de FoxP3 qui seront réalisées à l'UCL).

1) Récupération immunitaire I (cytométrie en flux). Les analyses suivantes seront effectuées (en commençant par 5 mL de sang).

2) Récupération immunitaire II. Isolement de sous-ensembles de lymphocytes T pour les analyses de la diversité du répertoire par séquençage de nouvelle génération (NGS ; à partir de 50 mL de sang). Les sous-ensembles suivants seront isolés (~50 000 cellules chacun) puis cryoconservés :

• Cellules T régulatrices CD4+ CD25+ (naïves, activées et mémoire),
• CD4+ CD25- lymphocytes T non régulateurs (naïfs/mémoire), et
• Lymphocytes T cytotoxiques CD8+ (naïfs/mémoire).