Infuze dárcovských regulačních T lymfocytů u pacientů s chronickým onemocněním štěpu proti hostiteli (GVHD)

LÉČEBNÝ PLÁN

1 Imunosupresivní léky (DTI a kontrolní ramena)

• Rapa bude zahájena do 2 týdnů po zařazení. Rapa bude podávána v nasycovací dávce 2-6 mg po dobu jednoho dne, poté bude následovat přibližně 1 mg denně k dosažení cílové minimální hladiny 5 až 10 ng/ml. Frekvence měření hladiny se bude provádět podle výběru zkoušejícího;
• Léčba přípravkem Rapa může být přerušena v případě vymizení chronické GVHD ≥ 3 měsíce nebo v případě nezvládnutelných vedlejších účinků nebo progrese chronické GVHD.
• Vysazení inhibitoru kalcineurinu do 2 týdnů po zahájení rapa. Žádná další úprava imunosupresiv a zejména žádné snížení dávky steroidů (pokud to není nutné pro nežádoucí účinky).

• Hodnocení chronické GVHD 60 dní po zahájení rapa. DTI nebude podáván pacientům, kteří měli progresi jejich GVHD 60. den, ani těm, kteří jsou v CR jejich GVHD.

  2. Odběr dárcovských lymfocytů (rameno DTI)

• Aferéza dárce bude provedena 60-90 dní po prvním dnu podávání rapa pacientovi. Před leukaferézou nebude dárce nijak zvlášť připravován. Po písemném informovaném souhlasu dárce podstoupí leukaferézy 1 den. Leukaferéza bude prováděna za použití kontinuálního průtokového separátoru krevních buněk a podle protokolu odběru mononukleárních buněk. Objem zpracované krve bude 20 litrů. Antikoagulace bude provedena roztokem ACD-A / heparin.

  3. Tregselekce a infuze (rameno DTI)

• Treg bude izolován na LTCG CHU v Lutychu z produktu aferézy pomocí separačního systému CliniMACS (MiltenyiBiotec) podle dvoukrokového postupu (deplece CD8 a CD19 následovaná pozitivní selekcí CD25) podle doporučení výrobce. Alikvoty (≈ 3 ml) produktu Treg budou uloženy pro analýzy.
• Treg bude podáván i.v. 60-90 dní po prvním dni podávání rapa a po vysazení inhibitoru kalcineurinu. V ovládacím rameni nebude provedeno žádné DTI.
• Nízká dávka Il-2 (1x106 IU/den) bude zahájena v den DTI a bude pokračovat po dobu 2 měsíců, aby se rozšířily infuzní dárcovské Tregs.

SLEDOVÁNÍ PACIENTŮ

1. Kontroly kvality buněčných produktů 1.1 Periferní krev.

   Ve dnech odběru lymfocytů budou v periferní krvi dárce provedeny následující laboratorní analýzy:

   • Počet jaderných buněk a diferenciál v automatickém počítadle buněk;

   1.1.2 Produkt leukaferézy, stejně jako počáteční, střední a konečné frakce Treg selekce.

   Následující laboratorní analýzy budou provedeny v odběru lymfocytů a také počáteční, střední a konečné frakce Treg selekce:

   • Počet jaderných buněk a diferenciál na automatickém počítadle buněk;

   • FACS analýza se stanovením % buněk (na celkových WBC) s markery: CD20-FITC (Miltenyi #130-091-110), CD14-PE (Miltenyi #130-091-412), CD15-PE (Miltenyi #130 -091-390), CD56-PE (Miltenyi #130-090-910), CD45-VioBlue (Miltenyi #130-092-497), CD8-APC (Miltenyi #130-091-083), PropidiumIodid (Miltenyi) -093-233), detekční sada T reg (CD4/Cd25/CD127) (Miltenyi #130-096-076) a detekční sada Treg #2 (CD4/CD25/Foxp3)-APC (Miltenyi #130-094-158 ).
   • Treg fenotyp s použitím následujících markerů: CD127, CD45RA, CCR4, CCR7 a KI67.
   • Odhad funkce Treg42.
   • Stav methylace CpG dinukleotidů umístěných v konzervované oblasti FoxP3 intronu
   • Životaschopnost buněk vyloučením trypanové modři.
   • Mikrobiologické testování včetně standardní virologie a bakteriální kultivace.

   1.1.3 Kritéria uvolnění.

   Pro uvolnění musí být splněna následující kritéria:

   • ≥ 0,5 x 106 buněk/kg příjemce;

   • ≥ 55 % CD4+FoxP3+;
   • Životaschopnost > 80 %;
   • <0,05 x 106 CD45+CD8+ buněk/kg.
2. Toxicita buněčných infuzí Potenciální toxicity spojené s infuzemi Treg budou pečlivě monitorovány standardními postupy.

3. Klinická data

   Pacient bude pečlivě sledován a budou zaznamenány následující klinické parametry:

   • Výskyt, načasování a závažnost akutní GVHD po DTI, její léčba a výsledek;

   • Vývoj chronické GVHD, její léčba a výsledek. Přesněji řečeno, chronická GVHD (včetně současné imunosupresivní terapie) bude hodnocena pro každý orgán podle revidovaného konsenzu NIH:
   • Výskyt, načasování a závažnost sekundární cytopenie, její léčba a výsledek;
   • Výskyt, načasování a závažnost bakteriálních, virových, plísňových a protozoálních infekcí
   • Případná doba hospitalizace;
   • Evoluce primárního maligního onemocnění: odpověď, pokud není v ČR v době zařazení, relaps, jeho léčba a výsledek;
   • Jakékoli jiné závažné komplikace spojené s transplantačním postupem;
   • Smrt a přežití.
4. Imunologická data (prováděná v GIGA na ULG pro všechny kromě analýz methylačního stavu CpG dinukleotidů umístěných v konzervované oblasti FoxP3 intronu 1, která bude provedena na UCL).

1) Obnova imunity I (průtoková cytometrie). Budou provedeny následující analýzy (počínaje 5 ml krve).

2) Imunitní zotavení II. Izolace podskupin T-buněk pro analýzy rozmanitosti repertoáru prostřednictvím sekvenování nové generace (NGS; počínaje 50 ml krve). Následující podmnožiny budou izolovány (každá ~ 50 000 buněk) a poté kryokonzervovány:

• CD4+ CD25+ regulační T buňky (naivní, aktivované a paměťové),
• CD4+ CD25- neregulační T buňky (naivní/paměťové) a
• CD8+ cytotoxické T buňky (naivní/paměťové).