Infusion regulatorischer Spender-T-Zellen bei Patienten mit chronischer Graft-versus-Host-Krankheit (GVHD)

BEHANDLUNGSPLAN

1 Immunsuppressive Medikamente (DTI und Kontrollarme)

• Rapa wird innerhalb von 2 Wochen nach Aufnahme gestartet. Rapa wird einen Tag lang in einer Aufsättigungsdosis von 2–6 mg verabreicht, gefolgt von etwa 1 mg täglich, um einen angestrebten Talspiegel von 5 bis 10 ng/ml zu erreichen. Die Häufigkeit der Talspiegelmessungen wird nach Wahl des Prüfarztes durchgeführt;
• Rapa kann abgesetzt werden, wenn die chronische GVHD ≥ 3 Monate abklingt oder wenn nicht beherrschbare Nebenwirkungen oder eine Progression der chronischen GVHD auftreten.
• Absetzen des Calcineurin-Inhibitors innerhalb von 2 Wochen nach Beginn von Rapa. Keine andere Modifikation von Immunsuppressiva und insbesondere keine Verringerung der Dosis von Steroiden (sofern nicht aufgrund von Nebenwirkungen erforderlich).

• Bewertung der chronischen GVHD 60 Tage nach Rapa-Beginn. DTI wird weder bei Patienten verabreicht, bei denen an Tag 60 eine Progression ihrer GVHD auftrat, noch bei Patienten, die sich in einer CR ihrer GVHD befinden.

  2. Entnahme von Spenderlymphozyten (DTI-Arm)

• Die Apherese des Spenders wird 60-90 Tage nach dem ersten Tag der Rapa-Verabreichung an den Patienten durchgeführt. Es gibt keine besondere Vorbereitung des Spenders vor der Leukapherese. Nach schriftlicher Einverständniserklärung wird der Spender an einem Tag Leukapheresen unterzogen. Die Leukapherese wird unter Verwendung eines Blutzellenseparators mit kontinuierlichem Durchfluss und nach einem Protokoll zur Sammlung mononukleärer Zellen durchgeführt. Das verarbeitete Blutvolumen beträgt 20 Liter. Die Antikoagulation wird mit der ACD-A/Heparin-Lösung durchgeführt.

  3. Treg-Auswahl und Infusion (DTI-Arm)

• Treg wird am LTCG der CHU Lüttich aus einem Aphereseprodukt mit dem CliniMACS-Trennsystem (MiltenyiBiotec) nach einem zweistufigen Verfahren (CD8- und CD19-Depletion gefolgt von CD25-positiver Selektion) gemäß den Empfehlungen des Herstellers isoliert. Aliquots (≈ 3 ml) des Treg-Produkts werden für Analysen aufbewahrt.
• Treg wird 60-90 Tage nach dem ersten Tag der Rapa-Verabreichung und nach Absetzen des Calcineurin-Inhibitors i.v. infundiert. Im Kontrollarm wird keine DTI durchgeführt.
• Il-2 in niedriger Dosis (1 x 106 IE/Tag) wird am Tag der DTI begonnen und über einen Zeitraum von 2 Monaten fortgesetzt, um infundierte Spender-Tregs zu erweitern.

NACHVERFOLGUNG DER PATIENTEN

1. Qualitätskontrollen von Zellprodukten 1.1 Peripheres Blut.

   An den Tagen der Lymphozytenentnahme werden folgende Laboranalysen im peripheren Blut des Spenders durchgeführt:

   • Zählung und Differenzierung kernhaltiger Zellen in einem automatisierten Zellzähler;

   1.1.2 Leukaphereseprodukt sowie Start-, Zwischen- und Endfraktion der Treg-Selektion.

   In der Lymphozytensammlung sowie Start-, Zwischen- und Endfraktion der Treg-Selektion werden folgende Laboranalysen durchgeführt:

   • Zählung kernhaltiger Zellen und Differential auf einem automatisierten Zellzähler;

   • FACS-Analyse mit Bestimmung der % Zellen (bezogen auf Gesamt-WBC) mit den Markern: CD20-FITC (Miltenyi #130-091-110), CD14-PE (Miltenyi #130-091-412), CD15-PE (Miltenyi #130 -091-390), CD56-PE (Miltenyi Nr. 130-090-910), CD45-VioBlue (Miltenyi Nr. 130-092-497), CD8-APC (Miltenyi Nr. 130-091-083), PropidiumIodid (Miltenyi Nr. 130 -093-233), Treg-Erkennungskit (CD4/Cd25/CD127) (Miltenyi Nr. 130-096-076) und Treg-Erkennungskit Nr. 2 (CD4/CD25/Foxp3)-APC (Miltenyi Nr. 130-094-158 ).
   • Treg-Phänotyp unter Verwendung der folgenden Marker: CD127, CD45RA, CCR4, CCR7 und KI67.
   • Schätzung der Treg-Funktion42.
   • Methylierungsstatus von CpG-Dinukleotiden, die sich in einer konservierten Region des FoxP3-Introns befinden
   • Zelllebensfähigkeit durch Trypanblau-Ausschluss.
   • Mikrobiologische Tests einschließlich Standardvirologie und Bakterienkultur.

   1.1.3 Freigabekriterien.

   Folgende Kriterien sollten für die Freigabe erfüllt sein:

   • ≥ 0,5 x 106 Zellen/kg Empfänger;

   • ≥ 55 % CD4+FoxP3+;
   • Lebensfähigkeit > 80 %;
   • <0,05 x 106 CD45+CD8+ Zellen/kg.
2. Toxizitäten von Zellinfusionen Potentielle Toxizitäten im Zusammenhang mit Treg-Infusionen werden gemäß Standardverfahren sorgfältig überwacht.

3. Klinische Daten

   Der Patient wird sorgfältig beobachtet und die folgenden klinischen Parameter werden aufgezeichnet:

   • Häufigkeit, Zeitpunkt und Schweregrad einer akuten GVHD nach DTI, ihre Behandlung und ihr Ergebnis;

   • Entwicklung der chronischen GVHD, ihre Behandlung und das Ergebnis. Genauer gesagt wird die chronische GVHD (einschließlich der aktuellen immunsuppressiven Therapie) für jedes Organ gemäß dem überarbeiteten NIH-Konsens bewertet:
   • Häufigkeit, Zeitpunkt und Schweregrad der sekundären Zytopenie, ihre Behandlung und das Ergebnis;
   • Häufigkeit, Zeitpunkt und Schweregrad von bakteriellen, viralen, Pilz- und Protozoeninfektionen
   • Dauer des Krankenhausaufenthalts, falls vorhanden;
   • Entwicklung der primären malignen Erkrankung: Ansprechen, falls nicht in CR zum Zeitpunkt des Einschlusses, Rückfall, seine Behandlung und Ergebnis;
   • Jede andere schwerwiegende Komplikation im Zusammenhang mit dem Transplantationsverfahren;
   • Tod und Überleben.
4. Immunologische Daten (durchgeführt im GIGA an der ULG für alle außer den Analysen des Methylierungsstatus von CpG-Dinukleotiden, die sich in einer konservierten Region von FoxP3-Intron 1 befinden, die an der UCL durchgeführt werden).

1) Immunerholung I (Durchflusszytometrie). Die folgenden Analysen werden durchgeführt (beginnend mit 5 ml Blut).

2) Immunerholung II. Isolierung von T-Zell-Untergruppen für Analysen der Repertoire-Diversität durch Next-Generation-Sequencing (NGS; ab 50 ml Blut). Die folgenden Teilmengen werden isoliert (jeweils ca. 50.000 Zellen) und dann kryokonserviert:

• CD4+ CD25+ regulatorische T-Zellen (naiv, aktiviert und Gedächtnis),
• CD4+ CD25- nicht-regulatorische T-Zellen (naiv/Gedächtnis) und
• CD8+ zytotoxische T-Zellen (naiv/Gedächtnis).