Infusão de células T reguladoras do doador em pacientes com doença crônica do enxerto contra o hospedeiro (GVHD)

PLANO DE TRATAMENTO

1 Drogas imunossupressoras (DTI e braços de controle)

• Rapa será iniciado dentro de 2 semanas após a inclusão. Rapa será administrado em dose de ataque de 2-6 mg por um dia, seguido de aproximadamente 1 mg por dia para atingir um nível mínimo alvo de 5 a 10 ng/mL. A frequência das medições do nível mínimo será feita de acordo com a escolha do investigador;
• Rapa pode ser descontinuado em caso de resolução da DECH crônica ≥ 3 meses ou em caso de efeitos colaterais incontroláveis ​​ou progressão da DECH crônica.
• Descontinuação do inibidor de calcineurina dentro de 2 semanas após o início do rapa. Nenhuma outra modificação de drogas imunossupressoras e, em particular, nenhuma diminuição na dose de esteróides (a menos que seja necessário para efeitos colaterais).

• Avaliação da DECH crônica 60 dias após o início da rapa. DTI não será administrado em pacientes que tiveram progressão de sua GVHD no dia 60 nem naqueles que estão em CR de sua GVHD.

  2. Coleta de linfócitos de doadores (braço DTI)

• A aférese do doador será realizada 60-90 dias após o primeiro dia de administração de rapa ao paciente. Não haverá preparação específica do doador antes da leucaférese. Após consentimento informado por escrito, o doador será submetido a leucaféreses em 1 dia. A leucaférese será realizada utilizando um separador de células sanguíneas de fluxo contínuo e seguindo um protocolo de coleta de células mononucleares. O volume de sangue processado será de 20 litros. A anticoagulação será realizada com a solução ACD-A/heparina.

  3. Seleção e infusão de Treg (braço DTI)

• Treg será isolado no LTCG do CHU de Liège a partir de produto de aférese com o sistema de separação CliniMACS (MiltenyiBiotec) seguindo um procedimento de duas etapas (depleção de CD8 e CD19 seguida de seleção positiva de CD25) de acordo com a recomendação do fabricante. Alíquotas (≈ 3 mL) do produto Treg serão salvas para análises.
• Treg será infundido i.v. 60-90 dias após o primeiro dia de administração de rapa e após a descontinuação do inibidor de calcineurina. Nenhum DTI será executado no braço de controle.
• Baixa dose de Il-2 (1x106 UI/dia) será iniciada no dia da DTI e será continuada por um período de 2 meses para expandir Tregs doadores infundidos.

ACOMPANHAMENTO DE PACIENTES

1. Controles de qualidade de produtos celulares 1.1 Sangue periférico.

   As seguintes análises laboratoriais serão realizadas no sangue periférico do doador nos dias das coletas de linfócitos:

   • Contagem de células nucleadas e diferencial em um contador de células automatizado;

   1.1.2 Produto de leucaférese, bem como frações inicial, intermediária e final da seleção de Treg.

   As seguintes análises laboratoriais serão realizadas na coleção de linfócitos, bem como nas frações inicial, intermediária e final da seleção de Treg:

   • Contagem de células nucleadas e diferencial em um contador de células automatizado;

   • Análise FACS com determinação da % de células (no total de WBC) com os marcadores: CD20-FITC (Miltenyi #130-091-110), CD14-PE (Miltenyi #130-091-412), CD15-PE (Miltenyi #130 -091-390), CD56-PE (Miltenyi #130-090-910), CD45-VioBlue (Miltenyi #130-092-497), CD8-APC (Miltenyi #130-091-083), PropidiumIodid(Miltenyi #130 -093-233), T reg Detection Kit (CD4/Cd25/CD127) (Miltenyi #130-096-076) e Treg Detection Kit #2 (CD4/CD25/Foxp3)-APC (Miltenyi #130-094-158 ).
   • Fenótipo Treg usando os seguintes marcadores: CD127, CD45RA, CCR4, CCR7 e KI67.
   • Estimativa da função Treg42.
   • Status de metilação de dinucleotídeos CpG localizados em uma região conservada do íntron FoxP3
   • Viabilidade celular por exclusão de azul de tripano.
   • Testes de microbiologia, incluindo virologia padrão e cultura bacteriana.

   1.1.3 Critérios de liberação.

   Os seguintes critérios devem ser atendidos para liberação:

   • ≥ 0,5 x106 células/kg receptor;

   • ≥ 55% CD4+FoxP3+;
   • Viabilidade > 80%;
   • <0,05 x 106 células CD45+CD8+/kg.
2. Toxicidade das infusões de células Toxicidades potenciais associadas às infusões de Treg serão cuidadosamente monitoradas de acordo com os procedimentos padrão.

3. Dados clínicos

   O paciente será cuidadosamente observado e os seguintes parâmetros clínicos serão registrados:

   • Incidência, tempo e gravidade da GVHD aguda após DTI, seu tratamento e resultado;

   • Evolução da DECH crônica, seu tratamento e evolução. Mais especificamente, a DECH crônica (incluindo a terapia imunossupressora atual) será avaliada para cada órgão de acordo com o consenso revisado do NIH:
   • Incidência, momento e gravidade da citopenia secundária, seu tratamento e resultado;
   • Incidência, momento e gravidade de infecções bacterianas, virais, fúngicas e protozoárias
   • Duração da internação, se houver;
   • Evolução da doença maligna primária: resposta se não em RC no momento da inclusão, recidiva, seu tratamento e evolução;
   • Qualquer outra complicação grave associada ao procedimento de transplante;
   • Morte e sobrevivência.
4. Dados imunológicos (realizados no GIGA no ULG para todos, exceto as análises do estado de metilação dos dinucleotídeos CpG localizados em uma região conservada do intron 1 FoxP3 que será realizada no UCL).

1) Recuperação imune I (citometria de fluxo). As seguintes análises serão realizadas (começando com 5 mL de sangue).

2) Recuperação imunológica II. Isolamento de subconjuntos de células T para análise da diversidade de repertório por meio de sequenciamento de próxima geração (NGS; a partir de 50 mL de sangue). Os seguintes subconjuntos serão isolados (~ 50.000 células cada) e depois criopreservados:

• Células T reguladoras CD4+ CD25+ (ingênuas, ativadas e de memória),
• Células T CD4+ CD25- não regulatórias (ingênuas/memória) e
• Células T citotóxicas CD8+ (ingênuas/memória).