Luovuttajien säätelevien T-solujen infuusio potilailla, joilla on krooninen siirrännäis-isäntätauti (GVHD)

HOITOSUUNNITELMA

1 Immunosuppressiiviset lääkkeet (DTI ja kontrollihaarat)

• Rapa aloitetaan 2 viikon sisällä sisällyttämisestä. Rapaa annetaan 2–6 mg:n kyllästysannoksena yhden päivän ajan, minkä jälkeen annetaan noin 1 mg päivässä, jotta saavutetaan tavoitetaso 5–10 ng/ml. Pohjatason mittausten tiheys tehdään tutkijan valinnan mukaan;
• Rapa-hoito voidaan lopettaa, jos krooninen GVHD paranee ≥ 3 kuukautta tai jos sivuvaikutuksia ei voida hallita tai krooninen GVHD etenee.
• Kalsineuriini-inhibiittori lopetetaan 2 viikon kuluessa rapan aloittamisesta. Immunosuppressiivisiin lääkkeisiin ei tehdä muita muutoksia eikä etenkään steroidiannoksen pienentämistä (ellei se ole välttämätöntä sivuvaikutusten vuoksi).

• Kroonisen GVHD:n arviointi 60 päivää rapan aloittamisen jälkeen. DTI:tä ei anneta potilaille, joiden GVHD:n eteneminen oli päivänä 60, eikä niille, jotka ovat GVHD:n CR-tilassa.

  2. Luovuttajien lymfosyyttien kerääminen (DTI-haara)

• Luovuttajan afereesi suoritetaan 60-90 päivää ensimmäisen rapan antopäivän jälkeen potilaalle. Luovuttajaa ei tehdä erityistä valmistelua ennen leukafereesia. Kirjallisen suostumuksen jälkeen luovuttajalle tehdään leukafereesit 1 päivänä. Leukafereesi suoritetaan käyttämällä jatkuvan virtauksen verisoluerotinta ja noudattamalla yksitumaisten solujen keräysprotokollaa. Käsiteltävän veren tilavuus on 20 litraa. Antikoagulaatio suoritetaan ACD-A/hepariiniliuoksella.

  3. Treg-valinta ja infuusio (DTI-haara)

• Treg eristetään Liègen CHU:n LTCG:ssä afereesituotteesta CliniMACS-erotusjärjestelmällä (MiltenyiBiotec) kaksivaiheisen menettelyn jälkeen (CD8- ja CD19-poisto ja CD25-positiivinen valinta) valmistajan suosituksen mukaisesti. Treg-tuotteen alikvootit (≈ 3 ml) tallennetaan analyyseja varten.
• Treg infusoidaan suonensisäisesti 60-90 päivää rapan ensimmäisen antopäivän jälkeen ja kalsineuriinin estäjän lopettamisen jälkeen. Ohjausvarressa ei suoriteta DTI:tä.
• Pieniannoksinen Il-2 (1x106 IU/vrk) aloitetaan DTI-päivänä ja sitä jatketaan 2 kuukauden ajan infusoitujen luovuttajien Tregien laajentamiseksi.

POTILASTEN SEURANTA

1. Solutuotteiden laadunvalvonta 1.1 Perifeerinen veri.

   Seuraavat laboratorioanalyysit tehdään luovuttajan ääreisverestä lymfosyyttikeräyspäivinä:

   • Tumallisten solujen lukumäärä ja ero automatisoidussa solulaskimessa;

   1.1.2 Leukafereesituote sekä Treg-valinnan aloitus-, väli- ja loppufraktiot.

   Lymfosyyttikokoelmassa tehdään seuraavat laboratorioanalyysit sekä Treg-valinnan aloitus-, väli- ja loppufraktiot:

   • Tumasolujen määrä ja erotus automaattisessa solulaskimessa;

   • FACS-analyysi soluprosentin määrityksellä (kokonaisvalkosolujen perusteella) markkereilla: CD20-FITC (Miltenyi #130-091-110), CD14-PE (Miltenyi #130-091-412), CD15-PE (Miltenyi #130) -091-390), CD56-PE (Miltenyi #130-090-910), CD45-VioBlue (Miltenyi #130-092-497), CD8-APC (Miltenyi #130-091-083), Propidiumjodidi (Miltenyi #13) -093-233), T reg Detection Kit (CD4/Cd25/CD127) (Miltenyi #130-096-076) ja Treg Detection Kit #2 (CD4/CD25/Foxp3)-APC (Miltenyi #130-094-158) ).
   • Treg-fenotyyppi käyttämällä seuraavia markkereita: CD127, CD45RA, CCR4, CCR7 ja KI67.
   • Treg-funktion estimointi42.
   • FoxP3-intronin konservoituneella alueella sijaitsevien CpG-dinukleotidien metylaatiotila
   • Solujen elinkelpoisuus trypaaninsinisellä poissulkemisella.
   • Mikrobiologiset testit, mukaan lukien standardi virologia ja bakteeriviljely.

   1.1.3Julkaisuehdot.

   Seuraavien kriteerien tulee täyttyä vapauttamiselle:

   • ≥ 0,5 x 106 solua/kg vastaanottajaa;

   • ≥ 55 % CD4+FoxP3+;
   • elinkelpoisuus > 80 %;
   • <0,05 x 106 CD45+CD8+-solua/kg.
2. Soluinfuusioiden toksisuus Treg-infuusioihin liittyviä mahdollisia toksisuuksia seurataan huolellisesti standardimenettelyjen mukaisesti.

3. Kliiniset tiedot

   Potilasta tarkkaillaan huolellisesti ja seuraavat kliiniset parametrit tallennetaan:

   • DTI:n jälkeisen akuutin GVHD:n ilmaantuvuus, ajoitus ja vakavuus, sen hoito ja tulos;

   • Kroonisen GVHD:n evoluutio, sen hoito ja lopputulos. Tarkemmin sanottuna krooninen GVHD (mukaan lukien nykyinen immunosuppressiohoito) arvioidaan kunkin elimen osalta tarkistetun NIH-konsensuksen mukaisesti:
   • Sekundaarisen sytopenian ilmaantuvuus, ajoitus ja vakavuus, sen hoito ja lopputulos;
   • Bakteeri-, virus-, sieni- ja alkueläininfektioiden ilmaantuvuus, ajoitus ja vakavuus
   • mahdollisen sairaalahoidon kesto;
   • Primaarisen pahanlaatuisen taudin evoluutio: vaste, jos ei CR:ssä sisällyttämishetkellä, uusiutuminen, sen hoito ja lopputulos;
   • Mikä tahansa muu elinsiirtotoimenpiteeseen liittyvä vakava komplikaatio;
   • Kuolema ja selviytyminen.
4. Immunologiset tiedot (suoritettu GIGA:ssa ULG:ssä kaikille paitsi FoxP3-intronin 1 konservoituneella alueella sijaitsevien CpG-dinukleotidien metylaatiotilan analyyseillä, jotka suoritetaan UCL:ssä).

1) Immuunin palautuminen I (virtaussytometria). Seuraavat analyysit suoritetaan (alkaen 5 ml:sta verta).

2) Immuunijärjestelmän palautuminen II. T-solualaryhmien eristäminen repertuaarin monimuotoisuuden analyyseja varten seuraavan sukupolven sekvensoinnilla (NGS; alkaen 50 ml:sta verta). Seuraavat osajoukot eristetään (kukin noin 50 000 solua) ja sitten kylmäsäilytetään:

• CD4+ CD25+ säätelevät T-solut (naiiveja, aktivoituja ja muistia),
• CD4+ CD25- ei-säätelevät T-solut (naiivit/muisti) ja
• CD8+ sytotoksiset T-solut (naiivit/muisti).