Infusión de células T reguladoras de donantes en pacientes con enfermedad crónica de injerto contra huésped (EICH)

PLAN DE TRATAMIENTO

1 Medicamentos inmunosupresores (DTI y brazos de control)

• Rapa se iniciará dentro de las 2 semanas posteriores a la inclusión. Rapa se administrará en una dosis de carga de 2 a 6 mg durante un día, seguida de aproximadamente 1 mg al día para alcanzar un nivel mínimo objetivo de 5 a 10 ng/mL. La frecuencia de las mediciones del nivel mínimo se realizará de acuerdo con la elección del investigador;
• Rapa puede interrumpirse en caso de resolución de la EICH crónica ≥ 3 meses o en caso de efectos secundarios inmanejables o progresión de la EICH crónica.
• Suspensión del inhibidor de calcineurina dentro de las 2 semanas posteriores al inicio de rapa. Ninguna otra modificación de los medicamentos inmunosupresores y, en particular, ninguna disminución de la dosis de esteroides (a menos que sea necesario por efectos secundarios).

• Evaluación de la EICH crónica 60 días después del inicio de la rapa. No se administrará DTI en pacientes que tuvieron una progresión de su GVHD en el día 60 ni en aquellos que están en RC de su GVHD.

  2. Colección de linfocitos de donantes (brazo DTI)

• La aféresis del donante se realizará 60-90 días después del primer día de administración de rapa al paciente. No habrá una preparación particular del donante previa a la leucoféresis. Después del consentimiento informado por escrito, el donante se someterá a leucaféresis en 1 día. La leucoféresis se realizará utilizando un separador de células sanguíneas de flujo continuo y siguiendo un protocolo de recolección de células mononucleares. El volumen de sangre procesada será de 20 litros. La anticoagulación se realizará con la solución de ACD-A/heparina.

  3. Selección e infusión de Treg (brazo DTI)

• La Treg se aislará en el LTCG del CHU de Lieja a partir del producto de aféresis con el sistema de separación CliniMACS (MiltenyiBiotec) siguiendo un procedimiento de dos pasos (agotamiento de CD8 y CD19 seguido de selección positiva de CD25) según la recomendación del fabricante. Se guardarán alícuotas (≈ 3 mL) del producto Treg para análisis.
• Treg se infundirá i.v. 60-90 días después del primer día de la administración de rapa y después de la suspensión del inhibidor de calcineurina. No se realizará ninguna DTI en el brazo de control.
• La dosis baja de Il-2 (1x106 UI/día) se iniciará el día de la DTI y se continuará durante un período de 2 meses para expandir las Treg del donante infundidas.

SEGUIMIENTO DE PACIENTES

1. Controles de calidad de los productos celulares 1.1 Sangre periférica.

   Los siguientes análisis de laboratorio se realizarán en la sangre periférica del donante en los días de recolección de linfocitos:

   • Recuento de células nucleadas y diferencial en un contador de células automatizado;

   1.1.2 Producto de leucoaféresis, así como fracciones inicial, intermedia y final de la selección de Treg.

   Los siguientes análisis de laboratorio se realizarán en la colección de linfocitos, así como fracciones de inicio, intermedio y final de la selección de Treg:

   • Recuento de células nucleadas y diferencial en un contador de células automatizado;

   • Análisis FACS con determinación del % de células (sobre total de WBC) con los marcadores: CD20-FITC (Miltenyi #130-091-110), CD14-PE (Miltenyi #130-091-412), CD15-PE (Miltenyi #130 -091-390), CD56-PE (Miltenyi n.º 130-090-910), CD45-VioBlue (Miltenyi n.º 130-092-497), CD8-APC (Miltenyi n.º 130-091-083), yoduro de propidio (Miltenyi n.º 130 -093-233), kit de detección de Treg (CD4/Cd25/CD127) (Miltenyi #130-096-076) y kit de detección de Treg#2 (CD4/CD25/Foxp3)-APC (Miltenyi #130-094-158 ).
   • Fenotipo Treg utilizando los siguientes marcadores: CD127, CD45RA, CCR4, CCR7 y KI67.
   • Estimación de la función Treg42.
   • Estado de metilación de los dinucleótidos CpG ubicados en una región conservada del intrón FoxP3
   • Viabilidad celular por exclusión con azul de tripán.
   • Pruebas de microbiología que incluyen virología estándar y cultivo bacteriano.

   1.1.3 Criterios de liberación.

   Se deben cumplir los siguientes criterios para la liberación:

   • ≥ 0,5 x106 células/kg receptor;

   • ≥ 55% CD4+FoxP3+;
   • Viabilidad > 80%;
   • <0,05 x 106 células CD45+CD8+/kg.
2. Toxicidades de las infusiones de células Las toxicidades potenciales asociadas con las infusiones de Treg se controlarán cuidadosamente según los procedimientos estándar.

3. Datos clinicos

   Se observará atentamente al paciente y se registrarán los siguientes parámetros clínicos:

   • Incidencia, momento y gravedad de la EICH aguda después de la DTI, su tratamiento y resultado;

   • Evolución de la EICH crónica, su tratamiento y evolución. Más específicamente, la EICH crónica (incluida la terapia inmunosupresora actual) se evaluará para cada órgano de acuerdo con el consenso NIH revisado:
   • Incidencia, momento y gravedad de la citopenia secundaria, su tratamiento y resultado;
   • Incidencia, momento y gravedad de las infecciones bacterianas, virales, fúngicas y protozoarias
   • Duración de la hospitalización si la hubiere;
   • Evolución de la enfermedad maligna primaria: respuesta si no en RC al momento de la inclusión, recaída, su tratamiento y evolución;
   • Cualquier otra complicación grave asociada con el procedimiento de trasplante;
   • Muerte y supervivencia.
4. Datos inmunológicos (realizados en el GIGA en la ULG para todos excepto los análisis del estado de metilación de los dinucleótidos CpG ubicados en una región conservada del intrón 1 de FoxP3 que se realizará en la UCL).

1) Recuperación inmune I (citometría de flujo). Se realizarán los siguientes análisis (empezando con 5 mL de sangre).

2) Recuperación inmunológica II. Aislamiento de subconjuntos de células T para análisis de diversidad de repertorio mediante secuenciación de nueva generación (NGS; a partir de 50 ml de sangre). Los siguientes subconjuntos se aislarán (~50 000 células cada uno) y luego se crioconservarán:

• Células T reguladoras CD4+ CD25+ (vírgenes, activadas y de memoria),
• CD4+ CD25- células T no reguladoras (naïve/memory), y
• Células T citotóxicas CD8+ (naïve/memory).