Инфузия донорских регуляторных Т-клеток у пациентов с хронической болезнью «трансплантат против хозяина» (РТПХ)

ПЛАН ЛЕЧЕНИЯ

1 Иммунодепрессанты (DTI и контрольные группы)

• Рапа будет запущена в течение 2 недель после включения. Rapa будет назначаться в нагрузочной дозе 2–6 мг в течение одного дня, а затем примерно по 1 мг в день для достижения целевого минимального уровня от 5 до 10 нг/мл. Частота измерений уровня желоба будет выполняться по выбору исследователя;
• Рапа может быть прекращен в случае разрешения хронической РТПХ в течение ≥ 3 месяцев или в случае развития неконтролируемых побочных эффектов или прогрессирования хронической РТПХ.
• Отмена ингибитора кальциневрина в течение 2 недель после начала приема рапы. Никакой другой модификации иммунодепрессантов и, в частности, никакого снижения дозы стероидов (за исключением случаев, когда это необходимо для возникновения побочных эффектов).

• Оценка хронической РТПХ через 60 дней после начала рапы. DTI не будет назначаться ни пациентам, у которых РТПХ прогрессировала на 60-й день, ни тем, кто находится в CR РТПХ.

  2. Сбор донорских лимфоцитов (рука DTI)

• Аферез донора проводится через 60-90 дней после первого дня введения рапы пациенту. Специальной подготовки донора перед лейкаферезом не проводится. После письменного информированного согласия донору в 1-е сутки будет проведен лейкаферез. Лейкаферез будет проводиться с использованием сепаратора клеток крови с непрерывным потоком и в соответствии с протоколом сбора мононуклеарных клеток. Объем перерабатываемой крови составит 20 литров. Антикоагуляция будет проводиться раствором ACD-A/гепарин.

  3. Выделение Treg и инфузия (группа DTI)

• Treg будет выделен в LTCG CHU Льежа из продукта афереза ​​с помощью системы разделения CliniMACS (MiltenyiBiotec) в соответствии с двухэтапной процедурой (истощение CD8 и CD19 с последующим положительным отбором CD25) в соответствии с рекомендациями производителя. Аликвоты (≈ 3 мл) продукта Treg будут сохранены для анализа.
• Treg будет вводиться внутривенно через 60-90 дней после первого дня введения рапы и после прекращения приема ингибитора кальциневрина. В рычаге управления DTI выполняться не будет.
• Низкая доза интерлейкина-2 (1x106 МЕ/день) будет начата в день DTI и будет продолжена в течение 2 месяцев для увеличения количества инфузируемых донорских Treg.

НАБЛЮДЕНИЕ ЗА ПАЦИЕНТАМИ

1. Контроль качества клеточных продуктов 1.1 Периферическая кровь.

   В дни забора лимфоцитов в периферической крови донора будут проводиться следующие лабораторные анализы:

   • Подсчет и дифференциация ядерных клеток в автоматическом счетчике клеток;

   1.1.2 Продукт лейкафереза, а также стартовая, промежуточная и конечная фракции селекции Treg.

   Следующие лабораторные анализы будут выполнены в коллекции лимфоцитов, а также в начальной, промежуточной и конечной фракциях выделения Treg:

   • Подсчет ядерных клеток и их дифференциация на автоматическом счетчике клеток;

   • FACS-анализ с определением % клеток (от общего количества лейкоцитов) с маркерами: CD20-FITC (Miltenyi #130-091-110), CD14-PE (Miltenyi #130-091-412), CD15-PE (Miltenyi #130). -091-390), CD56-PE (Милтени № 130-090-910), CD45-VioBlue (Милтени № 130-092-497), CD8-APC (Милтени № 130-091-083), пропидиумйодид (Милтени № 130). -093-233), набор для обнаружения T reg (CD4/Cd25/CD127) (Miltenyi #130-096-076) и набор для обнаружения Treg #2 (CD4/CD25/Foxp3)-APC (Miltenyi #130-094-158). ).
   • Фенотип Treg с использованием следующих маркеров: CD127, CD45RA, CCR4, CCR7 и KI67.
   • Оценка функции Treg42.
   • Статус метилирования динуклеотидов CpG, расположенных в консервативной области интрона FoxP3
   • Жизнеспособность клеток по исключению трипанового синего.
   • Микробиологическое тестирование, включая стандартную вирусологию и бактериальную культуру.

   1.1.3 Критерии выпуска.

   Для освобождения должны быть соблюдены следующие критерии:

   • ≥ 0,5 x106 клеток/кг реципиента;

   • ≥ 55% CD4+FoxP3+;
   • Жизнеспособность > 80%;
   • <0,05 x 106 CD45+CD8+ клеток/кг.
2. Токсичность клеточных инфузий Потенциальная токсичность, связанная с инфузиями Treg, будет тщательно контролироваться в соответствии со стандартными процедурами.

3. Клинические данные

   Пациент будет тщательно наблюдаться, и будут зарегистрированы следующие клинические параметры:

   • Частота, время и тяжесть острой РТПХ после DTI, ее лечение и исход;

   • Эволюция хронической РТПХ, ее лечение и исход. В частности, хроническая РТПХ (включая текущую иммуносупрессивную терапию) будет оцениваться для каждого органа в соответствии с пересмотренным консенсусом NIH:
   • Частота, время и тяжесть вторичной цитопении, ее лечение и исход;
   • Заболеваемость, сроки и тяжесть бактериальных, вирусных, грибковых и протозойных инфекций
   • Продолжительность госпитализации, если таковая имеется;
   • Эволюция первичного злокачественного заболевания: ответ, если не было ПР на момент включения, рецидив, его лечение и исход;
   • Любые другие серьезные осложнения, связанные с процедурой трансплантации;
   • Смерть и выживание.
4. Иммунологические данные (выполнены в GIGA в ULG для всех, кроме анализов статуса метилирования динуклеотидов CpG, расположенных в консервативной области интрона 1 FoxP3, которые будут выполняться в UCL).

1) Восстановление иммунитета I (проточная цитометрия). Будут выполнены следующие анализы (начиная с 5 мл крови).

2) Восстановление иммунитета II. Выделение подмножеств Т-клеток для анализа разнообразия репертуара посредством секвенирования следующего поколения (NGS; начиная с 50 мл крови). Следующие подмножества будут выделены (~ 50 000 клеток в каждом), а затем криоконсервированы:

• CD4+ CD25+ регуляторные Т-клетки (наивные, активированные и клетки памяти),
• CD4+ CD25- нерегуляторные Т-клетки (наивные/память) и
• CD8+ цитотоксические Т-клетки (наивные/память).