慢性移植片対宿主病 (GVHD) 患者におけるドナー制御性 T 細胞注入

治療計画

1 免疫抑制剤 (DTI および対照群)

• Rapa は、組み込み後 2 週間以内に開始されます。 Rapa は、1 日 2～6 mg の負荷量で投与され、その後、5～10 ng/mL の目標トラフ レベルを達成するために、毎日約 1 mg が投与されます。 トラフレベル測定の頻度は、研究者の選択に従って行われます。
• ラパは、慢性 GVHD が 3 か月以上回復した場合、または管理不能な副作用または慢性 GVHD の進行が見られた場合、中止することができます。
• rapa開始後2週間以内にカルシニューリン阻害剤の中止。 免疫抑制剤の他の変更はなく、特にステロイドの投与量の減少はありません（副作用のために必要でない限り）.

• ラパ開始から60日後の慢性GVHDの評価。 DTI は、60 日目に GVHD が進行した患者や、GVHD が CR にある患者には投与されません。

  2. ドナーリンパ球の収集 (DTI アーム)

• ドナーのアフェレーシスは、患者へのラパ投与の初日から60〜90日後に行われます。白血球アフェレーシスの前にドナーの特別な準備はありません。 書面によるインフォームド コンセントの後、ドナーは 1 日で白血球除去を受けます。 白血球除去は、連続フロー血球分離器を使用し、単核細胞収集プロトコルに従って実行されます。 処理される血液の量は20リットルになります。 抗凝固は、ACD-A / ヘパリン溶液で実行されます。

  3. Tregselection と注入 (DTI アーム)

• Treg は、リエージュの CHU の LTCG で、CliniMACS 分離システム (MiltenyiBiotec) を使用して、メーカーの推奨に従って 2 段階の手順 (CD8 および CD19 の除去とそれに続く CD25 のポジティブ選択) を使用して、アフェレーシス製品から分離されます。 Treg 製品のアリコート (≈ 3 mL) は分析用に保存されます。
• Tregは、ラパ投与の初日から60〜90日後、およびカルシニューリン阻害剤の中止後に静脈内注入されます。 コントロール アームでは DTI は実行されません。
• 低用量 Il-2 (1x106 IU/日) は、DTI の日に開始され、注入されたドナー Treg を拡大するために 2 か月間継続されます。

患者のフォローアップ

1. 細胞製品の品質管理 1.1 末梢血。

   リンパ球採取の日に、ドナーの末梢血で次の検査分析が行われます。

   • 自動セルカウンターでの有核細胞数と差。

   1.1.2 白血球除去産物、および Treg 選択の開始、中間、および最終画分。

   次の実験室分析は、リンパ球コレクション、およびTreg選択の開始、中間、および最終画分で実行されます。

   • 自動セルカウンターでの有核細胞のカウントと差異。

   • マーカーを使用した (全 WBC に対する) % 細胞の決定による FACS 分析: CD20-FITC (Miltenyi #130-091-110)、CD14-PE (Miltenyi #130-091-412)、CD15-PE (Miltenyi #130) -091-390)、CD56-PE (Miltenyi #130-090-910)、CD45-VioBlue (Miltenyi #130-092-497)、CD8-APC (Miltenyi #130-091-083)、PropidiumIodid(Miltenyi #130) -093-233)、T reg Detection Kit (CD4/Cd25/CD127) (Miltenyi #130-096-076)、および Treg Detection Kit#2 (CD4/CD25/Foxp3)-APC (Miltenyi #130-094-158) ）。
   • 次のマーカーを使用した Treg 表現型: CD127、CD45RA、CCR4、CCR7、および KI67。
   • Treg機能の推定42。
   • FoxP3イントロンの保存領域に位置するCpGジヌクレオチドのメチル化状態
   • トリパンブルー排除による細胞生存率。
   • 標準的なウイルス学および細菌培養を含む微生物学検査。

   1.1.3リリース基準。

   リリースするには、次の基準を満たす必要があります。

   • ≥ 0.5 x106 細胞/kg レシピエント;

   • ≥ 55% CD4+FoxP3+;
   • 生存率 > 80%;
   • <0.05 x 106 CD45+CD8+ 細胞/kg。
2. 細胞注入の毒性 Treg注入に関連する潜在的な毒性は、標準的な手順に従って注意深く監視されます。

3. 臨床データ

   患者は注意深く観察され、次の臨床パラメーターが記録されます。

   • DTI 後の急性 GVHD の発生率、時期および重症度、その治療および転帰。

   • 慢性GVHDの進化、その治療と転帰。 より具体的には、慢性GVHD（現在の免疫抑制療法を含む）は、改訂されたNIHコンセンサスに従って各臓器について評価されます。
   • 二次性血球減少症の発生率、時期および重症度、その治療および結果;
   • 細菌、ウイルス、真菌、原虫感染の発生率、時期、重症度
   • 入院期間がある場合はその期間。
   • 原発性悪性疾患の進展：組み入れ時に CR でない場合の反応、再発、その治療および転帰。
   • -移植手順に関連するその他の深刻な合併症;
   • 死と生存。
4. 免疫学的データ (UCL で実施される FoxP3 イントロン 1 の保存領域に位置する CpG ジヌクレオチドのメチル化状態の分析を除くすべてについて、ULG で GIGA で実施)。

1) 免疫回復 I (フローサイトメトリー)。 次の分析が実行されます (5 mL の血液から開始)。

２）免疫回復Ⅱ． 次世代シーケンシング (NGS; 50 mL の血液から開始) によるレパートリーの多様性の分析のための T 細胞サブセットの分離。 次のサブセットが分離され (それぞれ約 50,000 細胞)、凍結保存されます。

• CD4+ CD25+ 制御性 T 細胞 (ナイーブ、活性化、メモリー)、
• CD4+ CD25- 非制御性 T 細胞 (ナイーブ/メモリー)、および
• CD8+ 細胞傷害性 T 細胞 (ナイーブ/メモリー)。