Infusione di cellule T regolatorie del donatore in pazienti con malattia cronica del trapianto contro l'ospite (GVHD)

PIANO DI TRATTAMENTO

1 Farmaci immunosoppressori (DTI e bracci di controllo)

• Rapa verrà avviato entro 2 settimane dall'inclusione. Rapa verrà somministrato a una dose di carico di 2-6 mg per un giorno, seguita da circa 1 mg al giorno per raggiungere un livello minimo target compreso tra 5 e 10 ng/mL. La frequenza delle misurazioni del livello di depressione sarà effettuata secondo la scelta del ricercatore;
• Rapa può essere interrotto in caso di risoluzione della GVHD cronica ≥ 3 mesi o in caso di effetti collaterali non gestibili o progressione della GVHD cronica.
• Interruzione dell'inibitore della calcineurina entro 2 settimane dall'inizio del rapa. Nessun'altra modifica dei farmaci immunosoppressori e in particolare nessuna diminuzione della dose di steroidi (a meno che non sia necessario per effetti collaterali).

• Valutazione della GVHD cronica 60 giorni dopo l'inizio del rapa. La DTI non verrà somministrata ai pazienti che hanno avuto una progressione della loro GVHD il giorno 60 né a quelli che sono in CR della loro GVHD.

  2. Raccolta dei linfociti del donatore (braccio DTI)

• L'aferesi del donatore verrà eseguita 60-90 giorni dopo il primo giorno di somministrazione di rapa al paziente. Non ci sarà alcuna preparazione particolare del donatore prima della leucaferesi. Dopo il consenso informato scritto, il donatore sarà sottoposto a leucaferesi in 1 giorno. La leucaferesi verrà eseguita utilizzando un separatore di cellule del sangue a flusso continuo e seguendo un protocollo di raccolta di cellule mononucleate. Il volume di sangue processato sarà di 20 litri. L'anticoagulazione verrà eseguita con la soluzione ACD-A / eparina.

  3. Tregselezione e infusione (braccio DTI)

• Le Treg saranno isolate presso l'LTCG della CHU di Liegi dal prodotto di aferesi con il sistema di separazione CliniMACS (MiltenyiBiotec) seguendo una procedura in due fasi (deplezione di CD8 e CD19 seguita da selezione positiva di CD25) secondo le raccomandazioni del produttore. Le aliquote (≈ 3 mL) del prodotto Treg verranno salvate per le analisi.
• Treg sarà infuso i.v.60-90 giorni dopo il primo giorno di somministrazione di rapa e dopo l'interruzione dell'inibitore della calcineurina. Nessun DTI verrà eseguito nel braccio di controllo.
• L'Il-2 a basso dosaggio (1x106 UI/giorno) inizierà il giorno del DTI e continuerà per un periodo di 2 mesi al fine di espandere le Treg donatrici infuse.

FOLLOW-UP DEI PAZIENTI

1. Controlli di qualità dei prodotti cellulari 1.1 Sangue periferico.

   Le seguenti analisi di laboratorio verranno eseguite nel sangue periferico del donatore nei giorni di raccolta dei linfociti:

   • Conta cellulare nucleata e differenziale in un contacellule automatizzato;

   1.1.2 Prodotto di leucaferesi e frazioni iniziali, intermedie e finali della selezione di Treg.

   Le seguenti analisi di laboratorio saranno eseguite nella raccolta dei linfociti e nelle frazioni iniziali, intermedie e finali della selezione Treg:

   • Conta cellulare nucleata e differenziale su contacellule automatizzato;

   • Analisi FACS con determinazione della % di cellule (sul totale WBC) con i marcatori: CD20-FITC (Miltenyi #130-091-110), CD14-PE (Miltenyi #130-091-412), CD15-PE (Miltenyi #130 -091-390), CD56-PE (Miltenyi #130-090-910), CD45-VioBlue (Miltenyi #130-092-497), CD8-APC (Miltenyi #130-091-083), PropidiumIodid (Miltenyi #130 -093-233), T reg Detection Kit (CD4/Cd25/CD127) (Miltenyi #130-096-076) e Treg Detection Kit#2 (CD4/CD25/Foxp3)-APC (Miltenyi #130-094-158 ).
   • Fenotipo Treg utilizzando i seguenti marcatori: CD127, CD45RA, CCR4, CCR7 e KI67.
   • Stima della funzione Treg42.
   • Stato di metilazione dei dinucleotidi CpG situati in una regione conservata dell'introne FoxP3
   • Vitalità cellulare mediante esclusione del tripan blu.
   • Test microbiologici inclusi virologia standard e coltura batterica.

   1.1.3Criteri di rilascio.

   I seguenti criteri devono essere soddisfatti per il rilascio:

   • ≥ 0,5 x106 cellule/kg ricevente;

   • ≥ 55% CD4+FoxP3+;
   • Vitalità > 80%;
   • <0,05 x 106 cellule CD45+CD8+/kg.
2. Tossicità delle infusioni di cellule Le potenziali tossicità associate alle infusioni di Treg saranno attentamente monitorate secondo le procedure standard.

3. Dati clinici

   Il paziente sarà attentamente osservato e verranno registrati i seguenti parametri clinici:

   • Incidenza, tempistica e gravità della GVHD acuta in seguito a DTI, suo trattamento ed esito;

   • Evoluzione della GVHD cronica, suo trattamento e risultati. Più specificamente, la GVHD cronica (inclusa l'attuale terapia immunosoppressiva) sarà valutata per ciascun organo secondo il consenso NIH rivisto:
   • Incidenza, tempistica e gravità della citopenia secondaria, suo trattamento ed esito;
   • Incidenza, timing e gravità delle infezioni batteriche, virali, fungine e da protozoi
   • Durata dell'eventuale ricovero;
   • Evoluzione della malattia maligna primitiva: risposta se non in CR al momento dell'inclusione, recidiva, suo trattamento ed esito;
   • Qualsiasi altra grave complicanza associata alla procedura di trapianto;
   • Morte e sopravvivenza.
4. Dati immunologici (eseguiti in GIGA presso l'ULG per tutti tranne le analisi dello stato di metilazione dei dinucleotidi CpG situati in una regione conservata dell'introne 1 di FoxP3 che verranno eseguiti presso l'UCL).

1) Recupero immunitario I (citometria a flusso). Verranno eseguite le seguenti analisi (a partire da 5 mL di sangue).

2) Recupero immunitario II. Isolamento di sottoinsiemi di cellule T per analisi della diversità del repertorio attraverso il sequenziamento di nuova generazione (NGS; a partire da 50 mL di sangue). Saranno isolati i seguenti sottoinsiemi (~50.000 cellule ciascuno) e successivamente criopreservati:

• Cellule T regolatorie CD4+ CD25+ (naïve, attivate e di memoria),
• CD4+ CD25- linfociti T non regolatori (naïve/memoria), e
• Cellule T citotossiche CD8+ (naïve/con memoria).