喉-气管组织工程化临床移植

在移植之前，患者将进行实验室和仪器评估。

移植前三天，患者将接受骨髓抽吸。 在完全封闭的 FDA 批准的自动系统（Sepax，BioSafe America，Inc.）中，将骨髓单核细胞（MNC）与红细胞（RBC）分离。 用 200 mL 体积的细胞培养基（DMEM+10% 白蛋白和 10% 自体血浆）重新悬浮的最终产品将被放入 600 mL 转移袋中。在临床使用前，将从袋子中取出 2 mL 产品，使用培养基和免疫荧光细胞术来测试无菌性，以表征细胞类型和活力。

移植前两天，患者将开始“加强”治疗，通过全身注射粒细胞集落刺激因子 (GCSF)（粒细胞，1 M IU/kg（最大 . 15 M IU) 和促红细胞生成素，400 IU/kg（最大 6,000IU）。 这些将在手术前两天注射。

InBreath 生物反应器（用于培养气管的特殊生物反应器）当前协议中的工作将涉及 Macchiarini P. ang 学院先前在成功的首次人体植入组织工程大气道替代品中使用的生物反应器设计。 该设备以 InBreath 3D 器官生物反应器（Harvard Bioscience, Inc.）的名称商业化，设计用于放置在组织培养箱内，由模块化聚砜器官室、电机单元和遥控器组成。 该腔室很容易从电机装置上拆卸下来，其聚砜结构允许使用皮奥里亚手术室中现成的标准气体等离子灭菌工艺进行灭菌。 电机单元为腔室内的组织支架提供一致的旋转，确保流体动力剪切力可控地应用于正在发育的气管结构。 全封闭的电机外壳可保护无刷电机免受培养箱内腐蚀性湿气的影响。 远程控制单元放置在孵化器外部，提供一种在不干扰孵化器环境的情况下调节转速的方法。

在移除用于植入之前，允许接种的构建体在生物反应器中孵育96小时。 基于之前使用 POSS-PCU（多面体低聚倍半硅氧烷-聚（碳酸酯-脲）聚氨酯）、PET（聚对苯二甲酸乙二醇酯）和 PET:PU（聚氨酯）合成支架的五个成人案例，支架的内外表面将接种新鲜分离的骨髓单核细胞部分。 生物反应器将以 0.5 循环/分钟的初始速度启动 18 小时（然后逐步增加至 2.5 循环/分钟）。 孵育将在移植手术前的 48 小时内进行。 该孵化方案在之前使用三种不同的合成纳米复合材料气管支架的案例中效果很好。

培养步骤：

气管再接种程序将在我们已建立且功能齐全的无菌培养 GMP（良好生产规范）设施中完成。

1. 分离的 MNC 将根据用于骨髓分离的 Sepax 2 方案制备，并重新悬浮在含有 0.9% 生理盐水（含 10% 人白蛋白）的 300 毫升袋中。
2. 灭菌后的支架（伽马辐照灭菌）、生物反应器（等离子灭菌）和手术器械（高压灭菌）将被放入层流罩中。
3. 所有操作细胞/生物反应器和支架的人员都将接受 GMP 等级标准的全面培训，即无菌手套、特定工作服等。
4. 生物反应器将在无菌条件下在通风橱内打开并放置在无菌组织上。 支架将安装在器官固定装置上并放入生物反应器中。 一旦支架被转移并固定到生物反应器中，MNC（+DMEM 加白蛋白和自体血浆）将被接种在支架表面。 将培养基（包括自体血浆和人白蛋白）添加到生物反应器室中至总体积为 200 毫升。
5. 这些因素将添加到培养基中：39.3 ng/mL (100 nmol/L) 地塞米松和 10 μg/mL 胰岛素。
6. 然后将生物反应器室（包括支架、MNC + 200 ml 培养基）放入培养箱中并安装到生物反应器的电机单元上（之前放置在培养箱内）。
7. 生物反应器将以 0.5 循环/分钟的初始速度启动 18 小时（然后逐步增加至 2.5 循环/分钟）。
8. 24 小时后，将额外添加 50 毫升上述培养基至室内总体积为 250 毫升。 此时，将用革兰氏染色法检测一小部分室液，然后将其注入培养基中以检查是否有污染。
9. 48 小时后，腔室将被打开，并收获等分试样用于培养和革兰氏染色。 将对新气管进行小活检以进行 MTT 活力测试。 一旦确定细胞是活的并且没有培养基污染的迹象（革兰氏染色和直接接种培养的临时读数），气管将被视为已准备好植入，患者将被置于麻醉状态下，手术程序将开始了。

移植日：

术中手术程序 移植的早晨将测试移植物的细胞生长（MTT 测试和革兰氏染色的无菌性以及中期培养结果的分析）。 一旦认为移植物已准备好植入，患者将接受全身气管内麻醉。

胸部和腹部手术切除气道受损段后，气道结构将在术中植入，在内表面上进行呼吸细胞活检。 然后移植物将被注射（调节）生长因子，包括 10 ng/mL 重组人转化生长因子-β3、10 nmol/L 重组甲状旁腺激素相关肽、100 nmol/L 地塞米松和 10 µg/mL 胰岛素、GCSF (10 µg/kg) 和促红细胞生成素 (40,000 UI)（刺激外周造血细胞的动员）。 然后将植入物在近端和远端吻合，以便使用缝合线重建气道缺损。 然后用大网膜瓣覆盖和包裹（从胃大弯处分离的脂肪血管化组织，在右侧或左侧胃网膜动脉上采集，然后经膈肌或胸骨下转移至纵隔），以保证对移植物和吻合口的长期保护，并获得间接移植物的新生血管。

移植后：

术后处理

为了促进再生过程，患者（目前体重约 13 公斤）将在术后期间通过全身注射进行药物治疗：

1. GCSF 的类似重组体（Granocyte，1000 万 IU/kg 至最大 3000 万 IU）
2. 促红细胞生成素的类似合成物（Epoetin alpha 或 beta 40,000 IU）

两种因子都将以合适的浓度给药，以刺激造血细胞的动员/募集，“再生”剂量不会产生任何副作用。 每隔一天监测一次血浆促红细胞生成素水平和血液计数（包括血红蛋白和白细胞计数）。 血红蛋白水平大于 15 g/dl 会引起对高粘度的担忧，并会迅速去除 10-20 cc/kg 的血液，并可能会促使连续输注肝素以将活化的部分凝血活酶时间 (APTT) 水平保持在40-60 秒。 高于 50-60,000/μl 的白细胞水平将被视为“有毒”，并将导致 GCSF 治疗减少/暂停，直到数量低于 30,000。 GCSF 和促红细胞生成素治疗将根据下表在移植后每隔一天进行一次，持续 2 周：

跟进

随访将在克拉斯诺达尔地区医院心胸外科进行，包括：

1. 第一周每天对移植气道进行内镜评估（可弯曲和/或硬性支气管镜检查），第二周每隔一天进行一次，之后前六个月每月一次，此后前 5 年每 6 个月一次.
2. 前两周每天用白细胞配方评估血细胞计数。
3. 在 2 周内每隔一天评估一次来自外周血的动员祖细胞。
4. 免疫原性评估。 移植后 3、7 和 30 天后，将采集血液样本，通过评估抗体来研究组织相容性。 免疫原性随访也将在移植后 3、6 和 12 个月后进行。
5. 术后妥布霉素吸入（2x5ml/天，持续 30 天）以防止肺炎和移植物细菌污染。
6. 将在随访的第 1 个月、第 3 个月和第 6 个月进行颈部和胸部的计算机断层扫描以及移植气道的三维重建，此后的前 5 年每 6 个月进行一次。