Kurkunpää-henkitorven kudostekninen kliininen transplantaatio

Ennen elinsiirtoa potilaille tehdään laboratorio- ja instrumentaaliarvioinnit.

Kolme päivää ennen elinsiirtoa potilaalle tehdään luuytimen aspiraatio. Luuytimen mononukleaariset solut (MNC) eristetään punasoluista (RBC) täysin suljetussa FDA:n hyväksymässä automaattisessa järjestelmässä (Sepax, BioSafe America, Inc.). Lopullinen tuote, joka on uudelleensuspendoitu soluviljelyväliaineeseen (DMEM+10 % albumiinia ja 10 % autologista plasmaa) 200 ml:n tilavuudessa, laitetaan 600 ml:n siirtopussiin. 2 ml tuotetta otetaan pussista ennen kliinistä käyttöä steriiliyden testaamiseksi käyttämällä viljelyalustaa ja immunofluoresoivaa sytometriaa solutyypin ja elinkelpoisuuden karakterisoimiseksi.

Kaksi päivää ennen elinsiirtoa potilas aloittaa "tehostehoidon" solujen mobilisoimiseksi systeemisillä injektioilla analogisia rekombinantteja granulosyyttipesäkkeitä stimuloivaa tekijää (GCSF) (Granocyte, 1 M IU/kg (max. 15 M IU) ja erytropoietiini, 400 IU/kg (max. 6 000 IU). Nämä ruiskutetaan kaksi päivää ennen leikkausta.

InBreath Bioreactor (erityinen bioreaktori henkitorven viljelyyn) Nykyisen protokollan työhön liittyy bioreaktorisuunnittelu, jota Macchiarini P. ang -opistot käyttivät aiemmin onnistuneessa kudosteknisesti suunnitellussa suuren hengitysteiden korvaavan implantissa. Laite, joka on kaupallistettu nimellä InBreath 3D Organ Bioreactor (Harvard Bioscience, Inc.), on suunniteltu sijoitettavaksi kudosviljelyinkubaattoriin ja koostuu modulaarisesta polysulfoni-elinkammiosta, moottoriyksiköstä ja kaukosäätimestä. Kammio on helposti irrotettavissa moottoriyksiköstä ja sen polysulfonirakenne mahdollistaa steriloinnin tavallisella kaasuplasmasterilointiprosessilla, joka on helposti saatavilla Peorian leikkaussalissa. Moottoriyksikkö pyörittää tasaisesti kudoksen pidikettä kammion sisällä, mikä varmistaa hydrodynaamisten leikkausvoimien hallitun kohdistamisen kehittyvään henkitorven rakenteeseen. Täysin suljettu moottorikotelo suojaa harjatonta moottoria inkubaattorin syövyttävältä kosteudelta. Kaukosäädin on sijoitettu inkubaattorin ulkopuolelle, mikä mahdollistaa pyörimisnopeuden säätämisen häiritsemättä inkubaattorin ympäristöä.

Ympätyn konstruktin annettiin inkuboitua bioreaktorissa 96 tuntia ennen poistamista istutusta varten. Perustuu viiteen aikaisempaan aikuisten tapaukseen, joissa käytettiin POSS-PCU:ta (polyhedral oligomeric silsesquioxane-poly(karbonaatti-urea)uretaani), PET (polyeteenitereftalaatti) ja PET:PU (polyuretaani) synteettisiä telineitä, scaffoldin sisä- ja ulkopinnat kylvetään juuri eristetyllä luuytimen mononukleaarisella solufraktiolla. Bioreaktori käynnistetään alkunopeudella 0,5 sykliä/min 18 tunnin ajan (sen jälkeen nostetaan asteittain 2,5 sykliin/min asti). Inkubointi tapahtuu 48 tunnin aikana ennen elinsiirtoa. Tämä inkubaatioprotokolla toimi erittäin hyvin aikaisemmissa tapauksissa käyttämällä kolmea erilaista synteettistä nanokomposiittia henkitorven telinettä.

Viljelyvaiheet:

Henkitorven uudelleenkylvötoimenpiteet suoritetaan aseptisessa viljelyssämme (Good Manufacturing Practice) -laitoksessamme, joka on perustettu ja täysin toimiva.

1. Eristetty MNC valmistetaan Sepax 2 -protokollan mukaisesti luuytimen erottamista varten ja suspendoidaan uudelleen 300 ml:n pussiin, joka sisältää 0,9 % normaalia suolaliuosta (jossa 10 % ihmisen albumiinia).
2. Steriloitu rakennusteline (gammasäteilysterilointi), bioreaktori (plasmasterilointi) ja kirurgiset instrumentit (autoklavoitu) sijoitetaan laminaariseen huppuun.
3. Kaikki soluja/bioreaktoria ja rakennustelinettä käsittelevät henkilöt koulutetaan noudattamaan GMP-luokan standardeja, nimittäin steriilejä käsineitä, erityisiä haalareita jne.
4. Bioreaktori avataan konepellin sisällä steriileissä olosuhteissa ja asetetaan steriilille kudokselle. Teline asennetaan urkujen kiinnitystelineisiin ja sijoitetaan bioreaktoriin. Kun teline on siirretty ja kiinnitetty bioreaktoriin, MNC (+DMEM plus albumiini ja autologinen plasma) kylvetään telineen pinnalle. Elatusaine (mukaan lukien autologinen plasma ja ihmisen albumiini) lisätään bioreaktorin kammioon 200 ml:n kokonaistilavuuteen.
5. Tekijät lisäävät väliaineeseen: 39,3 ng/ml (100 nmol/L) deksametasonia ja 10 μg/ml insuliinia.
6. Sitten bioreaktorin kammio (sisältäen telineen, MNC + 200 ml väliainetta) asetetaan inkubaattoriin ja kiinnitetään bioreaktorin moottoriyksikköön (aiemmin inkubaattorin sisään).
7. Bioreaktori käynnistetään alkunopeudella 0,5 sykliä/min 18 tunnin ajan (sen jälkeen nostetaan asteittain 2,5 sykliin/min asti).
8. 24 tunnin kuluttua kammion sisällä lisätään vielä 50 ml edellä mainittua alustaa 250 ml:n kokonaistilavuuteen. Tällä hetkellä pieni osa kammionestettä testataan grammavärjäyksellä ja ruiskutetaan viljelyalustaan ​​kontaminaatioiden tarkistamiseksi.
9. 48 tunnin kuluttua kammio avataan ja alikvootti kerätään viljelmää ja Gram-värjäystä varten. Neotrakeasta otetaan pieni biopsia MTT-elinkelpoisuustestiä varten. Kun on todettu, että solut ovat eläviä eikä elatusainekontaminaatiosta ole merkkejä (Gram-värjäys ja suoran inokulaatioviljelmän väliluku), henkitorven katsotaan olevan valmis implantaatiota varten ja potilas asetetaan anestesiaan ja kirurginen toimenpide suoritetaan. alkoi.

Elinsiirtopäivä:

Intraoperatiivinen kirurginen toimenpide Siirteen aamuna siirrettä testataan solukasvun suhteen (MTT-testi ja steriiliys grammavärjäyksellä ja väliviljelytulosten analysointi). Kun siirteen katsotaan olevan valmis implantointia varten, potilas asetetaan yleisanestesiaan.

Rintakehä ja vatsatoimenpiteet Kun hengitysteiden vaurioituneen segmentin resektio on suoritettu, hengitystiekonstruktioon kylvetään intraoperatiivisesti hengityssolubiopsiat sisäpinnalle. Sitten siirrännäiseen injektoidaan (käsitellään) kasvutekijöitä, mukaan lukien 10 ng/ml ihmisen rekombinanttia transformoivaa kasvutekijä-β3:a, 10 nmol/l rekombinanttia lisäkilpirauhashormoniin liittyvää peptidiä, 100 nmol/l deksametasonia ja 10 µg/ml insuliinia. , GCSF (10 ug/kg) ja erytropoietiini (40 000 UI) (stimuloimaan perifeeristen hematopoieettisten solujen mobilisaatiota). Implantti anastomoidaan sitten proksimaalisesti ja distaalisesti hengitystievaurion rekonstruoimiseksi käyttämällä ompeleita. Sen jälkeen se peitetään ja kääritään suurella omentum-läpällä (rasva-vaskularisoitunut kudos, joka on irrotettu mahalaukun suuresta mutkasta, kerätään oikealta tai vasemmalta gastroepiploikaalisesta valtimosta ja siirretään sitten välikarsinaan trans-diafragmaattisesti tai substernaalisesti). takaavat siirteen ja anastomoosin pitkäaikaisen suojan ja saavat aikaan siirteen epäsuoran uudissuonittumisen.

Siirron jälkeen:

Leikkauksen jälkeinen hoito

Regeneratiivisen prosessin tehostamiseksi potilasta (nykyinen paino noin 13 kg) hoidetaan farmakologisesti leikkauksen jälkeisenä aikana systeemisillä injektioilla:

1. GCSF:n analogiset rekombinantit (Granocyte, 10 miljoonaa IU/kg, enintään 30 miljoonaa IU)
2. Erytropoietiinin analoginen synteettinen aine (epoetiini alfa tai beeta 40 000 IU)

Molempia tekijöitä annetaan sopivina pitoisuuksina hematopoieettisten solujen mobilisoinnin/rekrytoinnin stimuloimiseksi "regeneratiivisina" annoksina, joihin ei ole liitetty mitään sivuvaikutuksia. Plasman erytropoietiinitasoa ja verenkuvaa (mukaan lukien hemoglobiini- ja valkosoluarvot) seurataan joka toinen päivä. Yli 15 g/dl hemoglobiinitasot herättävät huolta hyperviskositeetista ja 10-20 cc/kg:n veren nopeasta poistosta ja voivat vaatia jatkuvan hepariiniinfuusion lisäämistä, jotta aktivoidun osittaisen tromboplastiiniajan (APTT) tasot pysyvät välillä 40-60 sekuntia. Yli 50-60 000/μl olevia valkosolupitoisuuksia pidetään "myrkyllisinä", ja ne johtavat GCSF-hoidon vähentämiseen/keskeytykseen, kunnes määrät laskevat alle 30 000:n. GCSF- ja erytropoietiinihoito suoritetaan joka toinen päivä 2 viikon ajan siirron jälkeen seuraavan taulukon mukaisesti:

Seuranta

Seuranta suoritetaan Krasnodarin aluesairaalan sydän- ja rintakehäkirurgian osastolla, ja se sisältää:

1. Siirrettyjen hengitysteiden endoskopinen arviointi (joustava ja/tai jäykkä bronkoskoopia) joka päivä ensimmäisen viikon ajan ja joka toinen päivä toisen viikon ajan, minkä jälkeen kerran kuukaudessa ensimmäisen kuuden kuukauden ajan ja sen jälkeen kuuden kuukauden välein ensimmäisten 5 vuoden ajan .
2. Verenkuvan arviointi valkosolukaavalla päivittäin kahden ensimmäisen viikon ajan.
3. Mobilisoitujen progenitorisolujen arviointi perifeerisestä verestä joka toinen päivä 2 viikon ajan.
4. Immunogeeninen arviointi. 3, 7 ja 30 päivän kuluttua siirrosta otetaan verinäyte, jotta voidaan tutkia histoyhteensopivuutta arvioimalla vasta-aineet. Immunogeeninen seuranta suoritetaan myös 3, 6 ja 12 kuukauden kuluttua siirrosta.
5. Leikkauksen jälkeinen tobramysiiniinhalaatio (2 x 5 ml/vrk 30 päivän ajan) keuhkokuumeen ja siirteen bakteerikontaminaation estämiseksi.
6. Kaulan ja rintakehän tietokonetomografia, jossa siirrettyjen hengitysteiden kolmiulotteinen rekonstruktio tehdään seurantakuukausina 1, 3 ja 6 seurantakuukausina ja sen jälkeen 6 kuukauden välein ensimmäisten 5 vuoden ajan.