Transplantation clinique à partir de tissus laryngo-trachéaux

Avant la transplantation, les patients auront les évaluations de laboratoire et instrumentales.

Trois jours avant la greffe, le patient subira une ponction de moelle osseuse. Les cellules mononucléaires de la moelle osseuse (MNC) seront isolées des globules rouges (RBC) dans le système automatique entièrement clos approuvé par la FDA (Sepax, BioSafe America, Inc.). Le produit final, remis en suspension avec du milieu de culture cellulaire (DMEM + 10 % d'albumine et 10 % de plasma autologue) dans un volume de 200 mL, sera placé dans une poche de transfert de 600 mL. 2 ml du produit seront prélevés du sac avant utilisation clinique pour tester la stérilité à l'aide de milieux de culture et de cytométrie immunofluorescente pour caractériser le type et la viabilité des cellules.

Deux jours avant la greffe, le patient commencera une thérapie « de rappel » pour mobiliser les cellules au moyen d'injections systémiques de recombinants analogues du facteur de stimulation des colonies de granulocytes (GCSF) (Granocyte, 1 M UI/kg (max. 15 M UI) et érythropoïétine, 400 UI/kg (max. 6 000 UI). Ceux-ci seront injectés pendant les deux jours précédant la chirurgie.

InBreath Bioreactor (le bioréacteur spécial pour la culture de la trachée) Le travail dans le protocole actuel impliquera une conception de bioréacteur précédemment utilisée par les collèges Macchiarini P. ang dans une première implantation réussie chez l'homme d'un remplacement des grandes voies respiratoires par ingénierie tissulaire. L'appareil, commercialisé sous le nom d'InBreath 3D Organ Bioreactor (Harvard Bioscience, Inc.) est conçu pour être placé dans un incubateur de culture tissulaire et se compose d'une chambre d'organe modulaire en polysulfone, d'une unité motrice et d'une télécommande. La chambre est facilement détachable de l'unité motrice et sa construction en polysulfone permet la stérilisation avec le processus standard de stérilisation au plasma gazeux qui est facilement disponible dans la salle d'opération de Peoria. L'unité motrice assure une rotation constante du support de tissu à l'intérieur de la chambre, assurant une application contrôlée des forces de cisaillement hydrodynamiques à la construction trachéale en développement. Un boîtier de moteur entièrement fermé protège le moteur sans balais de l'humidité corrosive à l'intérieur de l'incubateur. La télécommande est placée à l'extérieur de l'incubateur, fournissant un moyen de régler la vitesse de rotation sans perturber l'environnement de l'incubateur.

La construction ensemencée a été laissée à incuber dans le bioréacteur pendant 96 heures avant d'être retirée pour implantation. Sur la base des cinq cas adultes précédents utilisant les échafaudages synthétiques POSS-PCU (Polyhedral oligomeric silsesquioxane-poly(carbonate-urea) urethane), PET(Polyéthylène téréphtalate) et PET:PU (Polyuréthane), les surfaces internes et externes de l'échafaudage seront être ensemencé avec la fraction de cellules mononucléaires de moelle osseuse fraîchement isolée. Le bioréacteur sera démarré avec une vitesse initiale de 0,5 cycles/min pendant 18 heures (puis augmentation progressive jusqu'à 2,5 cycles/min). L'incubation aura lieu pendant les 48 heures précédant la procédure de transplantation. Ce protocole d'incubation a très bien fonctionné dans les cas précédents en utilisant les trois différents échafaudages trachéaux nanocomposites synthétiques.

Étapes de culture :

La procédure de réensemencement trachéale sera effectuée dans notre installation de culture aseptique GMP (Good Manufacturing Practice) qui a été établie et entièrement fonctionnelle.

1. Les MNC isolées seront préparées selon le protocole Sepax 2 pour la séparation de la moelle osseuse et remises en suspension dans une poche de 300 ml contenant une solution saline normale à 0,9 % (avec 10 % d'albumine humaine).
2. L'échafaudage stérilisé (stérilisation par irradiation gamma), le bioréacteur (stérilisation au plasma) et les instruments chirurgicaux (autoclavés) seront placés dans la hotte laminaire.
3. Toutes les personnes qui manipulent les cellules/le bioréacteur et l'échafaudage seront entièrement formées aux normes de qualité GMP, à savoir des gants stériles, des combinaisons spécifiques, etc.
4. Le bioréacteur sera ouvert à l'intérieur de la hotte dans des conditions stériles et placé sur un tissu stérile. L'échafaudage sera monté sur les appareils de maintien d'organes et placé dans le bioréacteur. Une fois l'échafaudage transféré et fixé dans le bioréacteur, le MNC (+ DMEM plus albumine et plasma autologue) sera ensemencé sur la surface de l'échafaudage. Le milieu (y compris le plasma autologue et l'albumine humaine) sera ajouté à la chambre du bioréacteur jusqu'à un volume total de 200 ml.
5. Les facteurs s'ajouteront au milieu : 39,3 ng/mL (100 nmol/L) de dexaméthasone et 10 μg/mL d'insuline.
6. Ensuite, la chambre du bioréacteur (y compris l'échafaudage, MNC + 200 ml de milieu) sera placée dans l'incubateur et montée sur l'unité motrice du bioréacteur (précédemment placée à l'intérieur de l'incubateur).
7. Le bioréacteur sera démarré avec une vitesse initiale de 0,5 cycle/min pendant 18h (puis augmentation progressive jusqu'à 2,5 cycles/min).
8. Après 24h, 50 ml supplémentaires du milieu susmentionné seront ajoutés à un volume total de 250 ml à l'intérieur de la chambre. À ce moment, une petite aliquote de liquide de la chambre sera testée avec une coloration de Gram et injectée dans un milieu de culture pour vérifier la contamination.
9. Après 48 heures, la chambre sera ouverte et une aliquote sera récoltée pour la culture et la coloration de Gram. Une petite biopsie de la néotrachée sera prise pour le test de viabilité MTT. Une fois qu'il est déterminé que les cellules sont viables et qu'il n'y a aucun signe de contamination du milieu (coloration de Gram et lecture intermédiaire de la culture d'inoculation directe), la trachée sera considérée comme prête pour l'implantation et le patient sera placé sous anesthésie et la procédure chirurgicale sera commencé.

Jour de greffe :

Procédure chirurgicale peropératoire Le matin de la greffe, le greffon sera testé pour la croissance cellulaire (test MTT et pour la stérilité par coloration de Gram et analyse des résultats intermédiaires de culture). Une fois que le greffon est jugé prêt pour l'implantation, le patient sera placé sous anesthésie générale endotrachéale.

Procédures thoraciques et abdominales Après avoir effectué la résection du segment endommagé des voies respiratoires, la construction des voies respiratoires sera ensemencée en peropératoire avec les biopsies de cellules respiratoires sur la surface interne. Le greffon sera ensuite injecté (conditionné) avec des facteurs de croissance, dont 10 ng/mL de facteur de croissance transformant humain recombinant-β 3, 10 nmol/L de peptide lié à l'hormone parathyroïdienne recombinante, 100 nmol/L dexaméthasone et 10 µg/mL d'insuline. , GCSF (10 µg/kg) et Erythropoïétine (40 000 UI) (pour stimuler la mobilisation des cellules hématopoïétiques périphériques). L'implant sera ensuite anastomosé en proximal et en distal afin de reconstruire le défect des voies respiratoires à l'aide de sutures. Il sera ensuite recouvert et enveloppé par un lambeau de grand omentum (tissu adipeux vascularisé détaché du grand pli de l'estomac, prélevé sur l'artère gastro-épiploïque droite ou gauche puis acheminé vers le médiastin par voie trans-diaphragmatique ou sous-sternale), pour garantir une protection à long terme du greffon et de l'anastomose et obtenir une néovascularisation indirecte du greffon.

Après transplantation :

Traitement post-opératoire

Pour relancer le processus de régénération, le patient (poids actuel d'environ 13 Kg) sera traité pharmacologiquement en période post-opératoire par des injections systémiques de :

1. Recombinants analogues du GCSF (Granocyte, 10 millions d'UI/kg jusqu'à un maximum de 30 millions d'UI)
2. Produits synthétiques analogues à l'érythropoïétine (époétine alpha ou bêta 40 000 UI)

Les deux facteurs seront administrés à des concentrations appropriées pour stimuler la mobilisation/recrutement des cellules hématopoïétiques, à des doses "régénératives" qui n'ont été associées à aucun effet secondaire. Tous les deux jours, le taux plasmatique d'érythropoïétine et la numération globulaire (y compris l'hémoglobine et le nombre de globules blancs) seront surveillés. Des taux d'hémoglobine supérieurs à 15 g/dl soulèveront des inquiétudes quant à l'hyperviscosité et à l'élimination rapide de 10 à 20 cc/kg de sang et peuvent inciter à ajouter une perfusion continue d'héparine pour maintenir les niveaux de temps de thromboplastine partielle activée (APTT) entre 40-60 secondes. Les niveaux de globules blancs supérieurs à 50-60 000/μl seront considérés comme "toxiques" et entraîneront une réduction/suspension de la thérapie GCSF jusqu'à ce que les nombres tombent en dessous de 30 000. Le traitement par GCSF et Erythropoïétine sera effectué un jour sur deux pendant 2 semaines après la greffe selon le tableau suivant :

Suivi

Le suivi sera effectué au service de chirurgie cardiothoracique de l'hôpital régional de Krasnodar et comprendra :

1. Évaluation endoscopique (bronchoscopie souple et/ou rigide) des voies respiratoires transplantées tous les jours pendant la première semaine et tous les deux jours pendant la deuxième semaine, puis une fois par mois pendant les six premiers mois, puis tous les 6 mois pendant les 5 premières années .
2. Évaluation quotidienne de la formule sanguine avec une formule de globules blancs pendant les deux premières semaines.
3. Évaluation des cellules progénitrices mobilisées du sang périphérique tous les deux jours pendant 2 semaines.
4. Évaluation immunogène. Après 3, 7 et 30 jours de la greffe, un échantillon de sang sera prélevé pour faire une étude de l'histocompatibilité en évaluant les anticorps. Le suivi immunogène sera également effectué après 3, 6 et 12 mois après la greffe.
5. Inhalation post-opératoire de Tobramycine (2x5ml/jour pendant 30 jours) pour prévenir la pneumonie et la contamination bactérienne du greffon.
6. Une tomodensitométrie du cou et du thorax avec une reconstruction tridimensionnelle des voies respiratoires transplantées sera effectuée au mois 1, au mois 3 et au mois 6 du suivi, puis tous les 6 mois pendant les 5 premières années.