Transplante Clínico de Tecido Laringo-Traqueal

Antes do transplante os pacientes passarão por avaliações laboratoriais e instrumentais.

Três dias antes do transplante o paciente será submetido a aspiração de medula óssea. As células mononucleares da medula óssea (MNC) serão isoladas dos glóbulos vermelhos (RBC) no sistema automático aprovado pela FDA totalmente fechado (Sepax, BioSafe America, Inc.). O produto final, ressuspenso com meio de cultura celular (DMEM+10% albumina e 10% plasma autólogo) em volume de 200 mL, será colocado em bolsa de transferência de 600 mL. Serão retirados 2 mL do produto da bolsa antes do uso clínico para testar a esterilidade usando meio de cultura e citometria imunofluorescente para caracterização do tipo celular e viabilidade.

Dois dias antes do transplante, o paciente iniciará a terapia de "boosting" para mobilizar células por meio de injeções sistêmicas de recombinantes análogos do fator estimulante de colônias de granulócitos (GCSF) (Granocyte, 1 M UI/kg (máx. 15 M UI) e Eritropoietina, 400 UI/kg (máx. 6.000 UI). Estes serão injetados nos dois dias anteriores à cirurgia.

Biorreator InBreath (o biorreator especial para cultivo de traqueia) O trabalho no protocolo atual envolverá um projeto de biorreator previamente utilizado pelas faculdades Macchiarini P. ang em um implante bem-sucedido, o primeiro no homem, de uma grande substituição de vias aéreas por engenharia de tecidos. O dispositivo, comercializado sob o nome, InBreath 3D Organ Bioreactor (Harvard Bioscience, Inc.) é projetado para colocação dentro de uma incubadora de cultura de tecidos e consiste em uma câmara de órgão de polissulfona modular, unidade motora e controle remoto. A câmara é facilmente destacável da unidade do motor e sua construção em polissulfona permite a esterilização com o processo padrão de esterilização por plasma a gás que está prontamente disponível na sala de cirurgia em Peoria. A unidade motora fornece rotação consistente para o suporte de tecido dentro da câmara, garantindo a aplicação controlada de forças de cisalhamento hidrodinâmicas na construção traqueal em desenvolvimento. Um invólucro do motor totalmente fechado protege o motor brushless da umidade corrosiva dentro da incubadora. A unidade de controle remoto é colocada fora da incubadora, proporcionando um meio de ajustar a velocidade de rotação sem perturbar o ambiente da incubadora.

A construção semeada foi incubada no biorreator por 96 horas antes da remoção para implantação. Com base nos cinco casos adultos anteriores usando os andaimes sintéticos POSS-PCU (poliédrico oligomérico silsesquioxano-poli(carbonato-ureia)), PET (polietileno tereftalato) e PET:PU (poliuretano), as superfícies internas e externas do andaime serão ser semeado com a fração de células mononucleares da medula óssea isolada recentemente. O biorreator será iniciado com uma velocidade inicial de 0,5 ciclos/min por 18 horas (depois aumentar gradualmente até 2,5 ciclos/min). A incubação será durante as 48 horas anteriores ao procedimento de transplante. Este protocolo de incubação funcionou muito bem nos casos anteriores usando os três andaimes traqueais nanocompósitos sintéticos diferentes.

Etapas de cultivo:

O procedimento de re-semeadura traqueal será feito em nossa instalação de cultura asséptica GMP (Boas Práticas de Fabricação) que foi estabelecida e totalmente funcional.

1. As MNC isoladas serão preparadas de acordo com o protocolo Sepax 2 para separação da medula óssea e ressuspensas em bolsa de 300ml contendo solução salina normal a 0,9% (com albumina humana a 10%).
2. O andaime esterilizado (esterilização por irradiação gama), o biorreator (esterilização por plasma) e os instrumentos cirúrgicos (autoclavados) serão colocados na capa laminar.
3. Todas as pessoas que estiverem manipulando as células/biorreator e andaime serão totalmente treinadas em padrões de grau GMP, ou seja, luvas estéreis, macacões específicos, etc.
4. O biorreator será aberto dentro do capô em condições estéreis e colocado sobre um tecido estéril. O andaime será montado nos dispositivos de retenção do órgão e colocado no biorreator. Uma vez que o scaffold é transferido e fixado no biorreator, o MNC (+DMEM mais albumina e plasma autólogo) será semeado na superfície do scaffold. Meio (incluindo plasma autólogo e albumina humana) será adicionado à câmara do biorreator até um volume total de 200 ml.
5. Os fatores serão adicionados ao meio: 39,3 ng/mL (100 nmol/L) dexametasona e 10 μg/mL de insulina.
6. Em seguida, a câmara do biorreator (incluindo o andaime, MNC + 200 ml de meio) será colocada na incubadora e montada na unidade motora do biorreator (previamente colocada dentro da incubadora).
7. O biorreator será iniciado com uma velocidade inicial de 0,5 ciclo/min por 18h (depois aumentar gradualmente até 2,5 ciclos/min).
8. Após 24h, serão adicionados mais 50ml do meio supracitado para um volume total de 250ml dentro da câmara. Neste momento, uma pequena alíquota do fluido da câmara será testada com coloração de Gram e injetada no meio de cultura para verificar se há contaminação.
9. Após 48 horas a câmara será aberta e uma alíquota será colhida para cultura e coloração de Gram. Uma pequena biópsia da neotraqueia será feita para o teste de viabilidade do MTT. Uma vez determinado que as células são viáveis ​​e não há sinais de contaminação do meio (coloração de Gram e leitura intermediária de cultura de inoculação direta), a traqueia será considerada pronta para implantação e o paciente será colocado sob anestesia e o procedimento cirúrgico será iniciado.

Dia do transplante:

Procedimento Cirúrgico Intra-operatório Na manhã do transplante, o enxerto será testado quanto ao crescimento celular (teste MTT e esterilidade por coloração de Gram e análise dos resultados intermediários da cultura). Assim que o enxerto for considerado pronto para implantação, o paciente será colocado sob anestesia geral endotraqueal.

Procedimentos torácicos e abdominais Realizada a ressecção do segmento danificado da via aérea, a construção da via aérea será semeada no intraoperatório com as biópsias de células respiratórias na superfície interna. O enxerto será então injetado (condicionado) com fatores de crescimento, incluindo 10 ng/mL de fator de crescimento transformador humano β 3 recombinante, 10 nmol/L de peptídeo relacionado ao hormônio da paratireoide recombinante, 100 nmol/L dexametasona e 10 µg/mL de insulina , GCSF (10 µg/kg) e Eritropoietina (40.000 UI) (para estimular a mobilização das células hematopoiéticas periféricas). O implante será então anastomosado proximal e distalmente para reconstruir o defeito da via aérea com suturas. Em seguida, será coberto e envolvido por um retalho de omento maior (tecido adiposo vascularizado destacado da grande curva do estômago, colhido na artéria gastroepiplóica direita ou esquerda e depois transportado para o mediastino transdiafragmaticamente ou subesternalmente), para garantir a proteção a longo prazo do enxerto e da anastomose e obter a neovascularização indireta do enxerto.

Após o transplante:

Tratamento pós-operatório

Para potencializar o processo regenerativo, o paciente (peso atual de cerca de 13 Kg) será tratado farmacologicamente no pós-operatório por meio de injeções sistêmicas de:

1. Recombinantes análogos de GCSF (Granocyte, 10 milhões de UI/kg até um máximo de 30 milhões de UI)
2. Análogos sintéticos de eritropoetina (Epoetina alfa ou beta 40.000 UI)

Ambos os fatores serão administrados em concentrações adequadas para estimular a mobilização/recrutamento de células hematopoiéticas, em doses "regenerativas" que não foram associadas a efeitos colaterais. A cada dois dias, o nível plasmático de eritropoietina e o hemograma (incluindo hemoglobina e contagem de glóbulos brancos) serão monitorados. Níveis de hemoglobina superiores a 15 g/dl levantam preocupações quanto à hiperviscosidade e remoção imediata de 10-20 cc/kg de sangue e podem levar à adição de uma infusão contínua de heparina para manter os níveis do Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (APTT) entre 40-60 segundos. Os níveis de glóbulos brancos acima de 50-60.000/μl serão considerados "tóxicos" e resultarão em uma redução/suspensão da terapia GCSF até que os números caiam abaixo de 30.000. O tratamento com GCSF e Eritropoetina será realizado em dias alternados durante 2 semanas após o transplante de acordo com a tabela a seguir:

Seguir

O acompanhamento será realizado no Departamento de Cirurgia Cardiotorácica do Hospital Regional de Krasnodar e incluirá:

1. Avaliação endoscópica (broncoscopia flexível e/ou rígida) da via aérea transplantada todos os dias na primeira semana e em dias alternados na segunda semana, após o que uma vez por mês nos primeiros seis meses e a cada 6 meses nos primeiros 5 anos .
2. Avaliação do hemograma com fórmula de glóbulos brancos diariamente nas duas primeiras semanas.
3. Avaliação das células progenitoras mobilizadas do sangue periférico a cada dois dias durante 2 semanas.
4. Avaliação imunogênica. Após 3, 7 e 30 dias do transplante, uma amostra de sangue será coletada para estudo de histocompatibilidade por meio da avaliação de anticorpos. O acompanhamento imunogênico também será feito após 3, 6 e 12 meses do transplante.
5. Inalação pós-operatória de Tobramicina (2x5ml/dia por 30 dias) para prevenir pneumonia e contaminação bacteriana do enxerto.
6. A tomografia computadorizada do pescoço e tórax com reconstrução tridimensional da via aérea transplantada será realizada no mês 1, mês 3 e mês 6 de acompanhamento e a cada 6 meses nos primeiros 5 anos.