Trapianto clinico di ingegneria tissutale laringo-tracheale

Prima del trapianto i pazienti avranno le valutazioni di laboratorio e strumentali.

Tre giorni prima del trapianto il paziente verrà sottoposto ad aspirazione del midollo osseo. Le cellule mononucleate del midollo osseo (MNC) saranno isolate dai globuli rossi (RBC) nel sistema automatico completamente chiuso approvato dalla FDA (Sepax, BioSafe America, Inc.). Il prodotto finale, risospeso con terreno di coltura cellulare (DMEM+10% albumina e 10% plasma autologo) in un volume di 200 mL, verrà posto in una sacca di trasferimento da 600 mL. 2 mL del prodotto saranno prelevati dalla sacca prima dell'uso clinico per testare la sterilità utilizzando terreni di coltura e citometria immunofluorescente per caratterizzare il tipo cellulare e la vitalità.

Due giorni prima del trapianto, il paziente inizierà una terapia di "potenziamento" per mobilizzare le cellule mediante iniezioni sistemiche di analoghi ricombinanti del fattore stimolante le colonie di granulociti (GCSF) (Granociti, 1 M UI/kg (max. 15 M UI) ed eritropoietina, 400 UI/kg (max. 6.000 UI). Questi saranno iniettati per i due giorni prima dell'intervento.

InBreath Bioreactor (il bioreattore speciale per coltivare la trachea) Il lavoro nell'attuale protocollo comporterà un progetto di bioreattore precedentemente utilizzato dai college Macchiarini P. ang in un primo impianto di successo nell'uomo di una sostituzione delle vie aeree di grandi dimensioni con ingegneria tissutale. Il dispositivo, commercializzato con il nome di InBreath 3D Organ Bioreactor (Harvard Bioscience, Inc.) è progettato per il posizionamento all'interno di un incubatore di coltura tissutale ed è costituito da una camera d'organo modulare in polisulfone, un'unità motoria e un telecomando. La camera è facilmente staccabile dall'unità motore e la sua costruzione in polisulfone consente la sterilizzazione con il processo standard di sterilizzazione a gas plasma che è facilmente disponibile nella sala operatoria di Peoria. L'unità motoria fornisce una rotazione costante al supporto del tessuto all'interno della camera, garantendo l'applicazione controllata delle forze di taglio idrodinamiche alla struttura tracheale in via di sviluppo. Un alloggiamento del motore completamente chiuso protegge il motore brushless dall'umidità corrosiva all'interno dell'incubatore. L'unità di controllo remoto è posizionata all'esterno dell'incubatore fornendo un mezzo per regolare la velocità di rotazione senza disturbare l'ambiente dell'incubatore.

Il costrutto seminato è stato lasciato incubare nel bioreattore per 96 ore prima della rimozione per l'impianto. Sulla base dei cinque precedenti casi di adulti che utilizzano gli scaffold sintetici POSS-PCU (Polyhedral oligomeric silsesquioxane-poly(carbonate-urea) urethan), PET (Polyethylene terefthalate) e PET:PU (Polyurethane), le superfici interne ed esterne dello scaffold essere seminato con la frazione di cellule mononucleate del midollo osseo appena isolata. Il bioreattore sarà avviato con una velocità iniziale di 0,5 cicli/min per 18 ore (poi gradualmente aumentata fino a 2,5 cicli/min). L'incubazione avverrà durante le 48 ore precedenti la procedura di trapianto. Questo protocollo di incubazione ha funzionato molto bene nei casi precedenti utilizzando i tre diversi scaffold tracheali sintetici nanocompositi.

Fasi di coltivazione:

La procedura di risemina tracheale verrà eseguita nella nostra struttura di coltura asettica GMP (Good Manufacturing Practice) che è stata istituita e perfettamente funzionante.

1. Le MNC isolate saranno preparate secondo il protocollo Sepax 2 per la separazione del midollo osseo e risospese in una sacca da 300 ml contenente una soluzione salina normale allo 0,9% (con il 10% di albumina umana).
2. Lo scaffold sterilizzato (sterilizzazione con raggi gamma), il bioreattore (sterilizzazione al plasma) e gli strumenti chirurgici (autoclavati) saranno posti nella cappa laminare.
3. Tutte le persone che manipolano le celle/il bioreattore e l'impalcatura saranno completamente addestrate ad avere standard di grado GMP, vale a dire guanti sterili, tute specifiche, ecc.
4. Il bioreattore verrà aperto all'interno della cappa in condizioni sterili e posto su un tessuto sterile. L'impalcatura sarà montata sui dispositivi di supporto degli organi e collocata nel bioreattore. Una volta che lo scaffold è stato trasferito e fissato nel bioreattore, le MNC (+DMEM più albumina e plasma autologo) saranno seminate sulla superficie dello scaffold. Il terreno (incluso plasma autologo e albumina umana) verrà aggiunto alla camera del bioreattore per un volume totale di 200 ml.
5. I fattori si aggiungeranno al terreno: 39,3 ng/mL (100 nmol/L) di desametasone e 10 μg/mL di insulina.
6. Quindi la camera del bioreattore (compreso lo scaffold, MNC + 200 ml di terreno) sarà collocata nell'incubatore e montata sull'unità motoria del bioreattore (precedentemente posizionata all'interno dell'incubatore).
7. Il bioreattore verrà avviato con una velocità iniziale di 0,5 cicli/min per 18 ore (quindi aumento graduale fino a 2,5 cicli/min).
8. Dopo 24 ore, verranno aggiunti altri 50 ml del terreno sopra menzionato per un volume totale di 250 ml all'interno della camera. A questo punto una piccola aliquota di liquido della camera verrà testata con colorazione di Gram e iniettata nel terreno di coltura per verificare la contaminazione.
9. Dopo 48 ore si aprirà la camera e si raccoglierà un'aliquota per la coltura e la colorazione di Gram. Verrà prelevata una piccola biopsia della neotrachea per il test di vitalità MTT. Una volta stabilito che le cellule sono vitali e non vi è alcun segno di contaminazione del mezzo (colorazione di Gram e lettura intermedia della coltura di inoculazione diretta), la trachea sarà ritenuta pronta per l'impianto e il paziente verrà posto sotto anestesia e la procedura chirurgica sarà iniziato.

Giorno del trapianto:

Procedura chirurgica intraoperatoria La mattina del trapianto l'innesto sarà testato per la crescita cellulare (test MTT e per la sterilità mediante colorazione di Gram e analisi dei risultati della coltura intermedia). Una volta che l'innesto è ritenuto pronto per l'impianto, il paziente verrà posto in anestesia endotracheale generale.

Procedure toraciche e addominali Dopo aver eseguito la resezione del segmento danneggiato delle vie aeree, il costrutto delle vie aeree sarà seminato intraoperatoriamente con le biopsie delle cellule respiratorie sulla superficie interna. L'innesto verrà quindi iniettato (condizionato) con fattori di crescita tra cui 10 ng/mL di fattore di crescita trasformante umano ricombinante-β 3, 10 nmol/L di peptide correlato all'ormone paratiroideo ricombinante, 100 nmol/L di desametasone e 10 µg/mL di insulina , GCSF (10 µg/kg) ed Eritropoietina (40.000 UI) (per stimolare la mobilizzazione delle cellule ematopoietiche periferiche). L'impianto verrà quindi anastomizzato prossimalmente e distalmente in modo da ricostruire il difetto delle vie aeree mediante punti di sutura. Verrà quindi ricoperto e avvolto da un lembo di omento maggiore (tessuto adiposo vascolarizzato staccato dal grande ansa dello stomaco, prelevato sull'arteria gastroepiploica destra o sinistra e poi riportato al mediastino per via transdiaframmatica o substernale), per garantire una protezione a lungo termine dell'innesto e dell'anastomosi e ottenere la neovascolarizzazione indiretta dell'innesto.

Dopo il trapianto:

Trattamento post-operatorio

Per potenziare il processo rigenerativo, il paziente (peso attuale circa 13 Kg) verrà trattato farmacologicamente nel periodo post-operatorio mediante iniezioni sistemiche di:

1. Analoghi ricombinanti di GCSF (Granociti, 10 milioni UI/kg fino ad un massimo di 30 milioni UI)
2. Sintetici analoghi di eritropoietina (epoetina alfa o beta 40.000 UI)

Entrambi i fattori saranno somministrati in concentrazioni idonee a stimolare la mobilizzazione/reclutamento delle cellule ematopoietiche, in dosi "rigenerative" che non sono state associate ad alcun effetto collaterale. Ogni due giorni verranno monitorati il ​​livello plasmatico di eritropoietina e la conta ematica (compresa la conta dell'emoglobina e dei globuli bianchi). Livelli di emoglobina superiori a 15 g/dl solleveranno preoccupazioni per l'iperviscosità e la pronta rimozione di 10-20 cc/kg di sangue e potrebbero richiedere l'aggiunta di un'infusione continua di eparina per mantenere i livelli del tempo di tromboplastina parziale attivata (APTT) tra 40-60 secondi. Livelli di globuli bianchi superiori a 50-60.000/μl saranno considerati "tossici" e comporteranno una riduzione/sospensione della terapia con GCSF fino a quando i numeri non scenderanno al di sotto di 30.000. Il trattamento con GCSF ed Eritropoietina verrà effettuato a giorni alterni per 2 settimane dopo il trapianto secondo la seguente tabella:

Seguito

Il follow-up sarà effettuato presso il Dipartimento di Chirurgia Cardiotoracica dell'Ospedale Regionale di Krasnodar e includerà:

1. Valutazione endoscopica (broncoscopia flessibile e/o rigida) delle vie aeree trapiantate tutti i giorni per la prima settimana e a giorni alterni per la seconda settimana, successivamente una volta al mese per i primi sei mesi, e successivamente ogni 6 mesi per i primi 5 anni .
2. Valutazione dell'emocromo con formula di globuli bianchi ogni giorno per le prime due settimane.
3. Valutazione delle cellule progenitrici mobilizzate dal sangue periferico a giorni alterni per 2 settimane.
4. Valutazione immunogenica. Dopo 3, 7 e 30 giorni dal trapianto verrà prelevato un campione di sangue per effettuare uno studio di istocompatibilità valutando gli anticorpi. Il follow-up immunogenico verrà effettuato anche dopo 3, 6 e 12 mesi dal trapianto.
5. Inalazione post-operatoria di tobramicina (2x5ml/giorno per 30 giorni) per prevenire la polmonite e la contaminazione batterica del trapianto.
6. La tomografia computerizzata del collo e del torace con ricostruzione tridimensionale delle vie aeree trapiantate verrà eseguita al mese 1, mese 3 e mese 6 del follow-up e successivamente ogni 6 mesi per i primi 5 anni.