Kliniczna transplantacja tkanki krtaniowo-tchawiczej

Przed przeszczepem pacjenci zostaną poddani ocenie laboratoryjnej i instrumentalnej.

Trzy dni przed przeszczepem u pacjenta zostanie wykonana aspiracja szpiku kostnego. Komórki jednojądrzaste szpiku kostnego (MNC) zostaną wyizolowane z krwinek czerwonych (RBC) w całkowicie zamkniętym automatycznym systemie zatwierdzonym przez FDA (Sepax, BioSafe America, Inc.). Produkt końcowy, ponownie zawieszony w pożywce do hodowli komórkowej (DMEM + 10% albuminy i 10% autologicznego osocza) w objętości 200 ml, zostanie umieszczony w worku transferowym o pojemności 600 ml. 2 ml produktu zostanie pobrane z worka przed użyciem klinicznym w celu przetestowania sterylności przy użyciu pożywki hodowlanej i cytometrii immunofluorescencyjnej w celu scharakteryzowania typu i żywotności komórek.

Na dwa dni przed przeszczepem pacjent rozpocznie terapię „wzmacniającą” w celu mobilizacji komórek poprzez ogólnoustrojowe wstrzyknięcia analogicznych rekombinantów czynnika wzrostu kolonii granulocytów (GCSF) (Granocyte, 1 M IU/kg (max. 15 mln j.m.) i erytropoetyna, 400 j.m./kg (maks. 6000 j.m.). Zostaną one wstrzyknięte na dwa dni przed operacją.

Bioreaktor InBreath (specjalny bioreaktor do hodowli tchawicy) Prace w obecnym protokole będą obejmowały projekt bioreaktora, który był wcześniej wykorzystywany przez uczelnie Macchiarini P. ang w udanej pierwszej w człowieku implantacji dużych dróg oddechowych za pomocą inżynierii tkankowej. Urządzenie, sprzedawane pod nazwą InBreath 3D Organ Bioreactor (Harvard Bioscience, Inc.), jest przeznaczone do umieszczenia w inkubatorze do hodowli tkankowych i składa się z modułowej komory organów polisulfonowych, jednostki silnikowej i pilota zdalnego sterowania. Komorę można łatwo odłączyć od jednostki silnikowej, a jej polisulfonowa konstrukcja umożliwia sterylizację za pomocą standardowego procesu sterylizacji plazmą gazową, który jest łatwo dostępny na sali operacyjnej w Peorii. Jednostka silnikowa zapewnia stałą rotację uchwytu tkanki w komorze, zapewniając kontrolowane przyłożenie hydrodynamicznych sił ścinających do rozwijającej się konstrukcji tchawicy. Całkowicie zamknięta obudowa silnika chroni silnik bezszczotkowy przed korozyjną wilgocią wewnątrz inkubatora. Jednostka zdalnego sterowania jest umieszczona na zewnątrz inkubatora, zapewniając środki do regulacji prędkości obrotowej bez zakłócania środowiska inkubatora.

Zaszczepiony konstrukt pozostawiono do inkubacji w bioreaktorze przez 96 godzin przed usunięciem w celu implantacji. W oparciu o pięć poprzednich przypadków dorosłych z użyciem syntetycznych rusztowań POSS-PCU (wielościenny oligomeryczny silseskwioksan-poli(węglan-mocznik)uretan), PET (politereftalan etylenu) i PET:PU (poliuretan), wewnętrzne i zewnętrzne powierzchnie rusztowania będą zaszczepić świeżo wyizolowaną frakcją komórek jednojądrzastych szpiku kostnego. Bioreaktor będzie uruchamiany z początkową prędkością 0,5 cykli/min przez 18 godzin (następnie stopniowo zwiększać do 2,5 cykli/min). Inkubacja będzie miała miejsce w ciągu 48 godzin poprzedzających procedurę przeszczepu. Ten protokół inkubacji działał bardzo dobrze w poprzednich przypadkach przy użyciu trzech różnych syntetycznych nanokompozytowych rusztowań tchawicy.

Etapy uprawy:

Procedura ponownego wysiewu tchawicy zostanie przeprowadzona w naszym zakładzie hodowli aseptycznej GMP (dobrej praktyki produkcyjnej), który został ustanowiony iw pełni funkcjonalny.

1. Wyizolowany MNC zostanie przygotowany zgodnie z protokołem Sepax 2 do separacji szpiku kostnego i ponownie zawieszony w 300 ml worku zawierającym 0,9% roztwór soli fizjologicznej (z 10% albuminą ludzką).
2. Wysterylizowane rusztowanie (sterylizacja promieniowaniem gamma), bioreaktor (sterylizacja plazmowa) oraz instrumenty chirurgiczne (autoklawowane) zostaną umieszczone w kapturze laminarnym.
3. Wszystkie osoby, które manipulują komórkami/bioreaktorem i rusztowaniem, zostaną w pełni przeszkolone w zakresie standardów GMP, a mianowicie sterylnych rękawiczek, specjalnych kombinezonów itp.
4. Bioreaktor zostanie otwarty wewnątrz okapu w sterylnych warunkach i umieszczony na sterylnej chusteczce. Rusztowanie zostanie zamontowane na uchwytach na narządy i umieszczone w bioreaktorze. Gdy rusztowanie zostanie przeniesione i zamocowane w bioreaktorze, MNC (+DMEM plus albumina i autologiczne osocze) zostanie wysiane na powierzchni rusztowania. Pożywka (w tym autologiczne osocze i albumina ludzka) zostanie dodana do komory bioreaktora do łącznej objętości 200 ml.
5. Czynniki dodadzą do pożywki: 39,3 ng/ml (100 nmol/l) deksametazonu i 10 μg/ml insuliny.
6. Następnie komora bioreaktora (w tym rusztowanie, MNC + 200 ml pożywki) zostanie umieszczona w inkubatorze i zamontowana na jednostce silnikowej bioreaktora (wcześniej umieszczonej w inkubatorze).
7. Bioreaktor będzie uruchamiany z początkową prędkością 0,5 cyklu/min przez 18h (następnie stopniowo zwiększać do 2,5 cykli/min).
8. Po 24h zostanie dodane dodatkowe 50ml wyżej wymienionej pożywki do całkowitej objętości 250ml wewnątrz komory. W tym czasie mała porcja płynu z komory zostanie przetestowana za pomocą barwienia metodą Grama i wstrzyknięta do pożywki hodowlanej w celu sprawdzenia zanieczyszczenia.
9. Po 48 godzinach komora zostanie otwarta i pobrana zostanie podwielokrotność do hodowli i barwienia metodą Grama. Mała biopsja tchawicy zostanie pobrana do testu żywotności MTT. Po stwierdzeniu, że komórki są zdolne do życia i nie ma śladów zanieczyszczenia pożywki (barwienie metodą Grama i tymczasowy odczyt hodowli z bezpośrednim posiewem), tchawica zostanie uznana za gotową do implantacji, a pacjent zostanie poddany znieczuleniu i zabieg chirurgiczny zostanie Rozpoczęty.

Dzień przeszczepu:

Śródoperacyjny zabieg chirurgiczny Rano w dniu przeszczepu przeszczep zostanie przetestowany pod kątem wzrostu komórek (test MTT i sterylność metodą Grama oraz analiza pośrednich wyników hodowli). Gdy proteza zostanie uznana za gotową do implantacji, pacjent zostanie poddany znieczuleniu ogólnemu dotchawiczemu.

Procedury klatki piersiowej i jamy brzusznej Po wykonaniu resekcji uszkodzonego odcinka dróg oddechowych konstrukt dróg oddechowych zostanie posiany śródoperacyjnie wycinkami komórek oddechowych na powierzchnię wewnętrzną. Przeszczep zostanie następnie wstrzyknięty (kondycjonowany) czynnikami wzrostu, w tym 10 ng/ml rekombinowanego ludzkiego transformującego czynnika wzrostu-β 3, 10 nmol/l rekombinowanego peptydu związanego z parathormonem, 100 nmol/l deksametazonu i 10 µg/ml insuliny , GCSF (10 µg/kg) i erytropoetyna (40 000 UI) (w celu stymulacji mobilizacji obwodowych komórek krwiotwórczych). Następnie implant zostanie zespolony proksymalnie i dystalnie w celu rekonstrukcji ubytku dróg oddechowych za pomocą szwów. Następnie zostanie on przykryty i owinięty płatem sieci większej (unaczyniona tkanka tłuszczowa oddzielona od dużego zagięcia żołądka, pobrana z prawej lub lewej tętnicy żołądkowo-sieciowej, a następnie przeniesiona do śródpiersia przez przeponę lub pod mostkiem), aby zapewnić długotrwałą ochronę przeszczepu i zespolenia oraz uzyskać pośrednią neowaskularyzację przeszczepu.

Po transplantacji:

Leczenie pooperacyjne

W celu przyspieszenia procesu regeneracyjnego pacjent (obecna waga ok. 13 kg) będzie leczony farmakologicznie w okresie pooperacyjnym poprzez ogólnoustrojowe iniekcje:

1. Analogiczne rekombinanty GCSF (granocyte, 10 milionów j.m./kg do maksymalnie 30 milionów j.m.)
2. Analogiczne syntetyki erytropoetyny (epoetyna alfa lub beta 40 000 IU)

Oba czynniki będą podawane w odpowiednich stężeniach w celu stymulacji mobilizacji/rekrutacji komórek krwiotwórczych, w dawkach „regeneracyjnych”, które nie wiążą się z żadnymi skutkami ubocznymi. Co drugi dzień będzie monitorowane stężenie erytropoetyny w osoczu i morfologia krwi (w tym liczba hemoglobiny i białych krwinek). Stężenie hemoglobiny powyżej 15 g/dl budzi obawy związane z nadmierną lepkością i szybkim usunięciem 10-20 cm3/kg krwi i może wymagać dodania ciągłego wlewu heparyny w celu utrzymania wartości czasu częściowej tromboplastyny ​​po aktywacji (APTT) pomiędzy 40-60 sekund. Poziomy białych krwinek powyżej 50-60 000/μl będą uważane za „toksyczne” i spowodują ograniczenie/zawieszenie terapii GCSF do momentu, gdy liczba spadnie poniżej 30 000. Leczenie GCSF i erytropoetyną będzie prowadzone co drugi dzień przez 2 tygodnie po przeszczepie zgodnie z poniższą tabelą:

Podejmować właściwe kroki

Obserwacja prowadzona będzie na Oddziale Kardiochirurgii Szpitala Okręgowego w Krasnodarze i obejmie:

1. Ocena endoskopowa (bronchoskopia elastyczna i/lub sztywna) przeszczepionych dróg oddechowych codziennie przez pierwszy tydzień i co drugi dzień przez drugi tydzień, następnie raz w miesiącu przez pierwsze sześć miesięcy, a następnie co 6 miesięcy przez pierwsze 5 lat .
2. Ocena morfologii krwi za pomocą formuły białych krwinek codziennie przez pierwsze dwa tygodnie.
3. Ocena zmobilizowanych komórek progenitorowych z krwi obwodowej co drugi dzień przez 2 tygodnie.
4. Ocena immunogenna. Po 3, 7 i 30 dniach od przeszczepu zostanie pobrana próbka krwi w celu wykonania badania zgodności tkankowej poprzez ocenę przeciwciał. Kontrola immunogenna prowadzona będzie również po 3, 6 i 12 miesiącach od przeszczepu.
5. Pooperacyjna inhalacja tobramycyny (2 x 5 ml/dobę przez 30 dni) w celu zapobieżenia zapaleniu płuc i kontaminacji bakteryjnej przeszczepu.
6. Tomografia komputerowa szyi i klatki piersiowej z trójwymiarową rekonstrukcją przeszczepionych dróg oddechowych będzie wykonywana w 1., 3. i 6. miesiącu obserwacji, a następnie co 6 miesięcy przez pierwsze 5 lat.