후두-기관 조직 공학 임상 이식

이식 전에 환자는 실험실 및 기기 평가를 받게 됩니다.

이식 3일 전에 환자는 골수 흡인을 받게 됩니다. 골수 단핵 세포(MNC)는 완전히 밀폐된 FDA 승인 자동 시스템(Sepax,BioSafe America, Inc.)에서 적혈구(RBC)로부터 분리됩니다. 200mL 부피의 세포 배양 배지(DMEM+10% 알부민 및 10% 자가 혈장)로 재현탁된 최종 제품을 600mL 이동 백에 넣습니다. 세포 유형 및 생존력을 특성화하기 위해 배양 배지 및 면역형광 세포측정법을 사용하여 무균성을 테스트하기 위해 임상 사용 전에 제품 2mL를 백에서 채취합니다.

이식 2일 전에 환자는 과립구 콜로니 자극 인자(GCSF)의 유사 재조합체(Granocyte, 1 M IU/kg(max. 15 M IU) 및 에리스로포이에틴, 400 IU/kg(최대 6,000IU). 이들은 수술 이틀 전에 주입됩니다.

InBreath Bioreactor(기관 배양을 위한 특수 생물 반응기) 현재 프로토콜의 작업에는 이전에 Macchiarini P. ang 대학에서 조직 공학적 대형 기도 교체의 성공적인 최초 이식에 사용했던 생물 반응기 설계가 포함됩니다. InBreath 3D Organ Bioreactor(Harvard Bioscience, Inc.)라는 이름으로 상업화된 이 장치는 조직 배양 인큐베이터 내에 배치하도록 설계되었으며 모듈식 폴리설폰 장기 챔버, 모터 유닛 및 원격 컨트롤러로 구성됩니다. 챔버는 모터 유닛에서 쉽게 분리할 수 있으며 폴리설폰 구조로 인해 Peoria의 수술실에서 쉽게 사용할 수 있는 표준 가스 플라즈마 멸균 프로세스로 멸균할 수 있습니다. 모터 유닛은 챔버 내의 조직 홀더에 일관된 회전을 제공하여 유체역학적 전단력을 발달 중인 기관 구성에 제어된 적용을 보장합니다. 완전히 밀폐된 모터 하우징은 인큐베이터 내의 부식성 습기로부터 브러시리스 모터를 보호합니다. 원격 제어 장치는 인큐베이터 외부에 배치되어 인큐베이터 환경을 방해하지 않고 회전 속도를 조정할 수 있는 수단을 제공합니다.

시딩된 구조물은 이식을 위해 제거하기 전에 96시간 동안 생물반응기에서 배양되도록 허용되었습니다. POSS-PCU(Polyhedral oligomeric silsesquioxane-poly(carbonate-urea) urethane), PET(Polyethylene terephthalate) 및 PET:PU(Polyurethane) 합성 발판을 사용한 기존 5건의 성인 사례를 기반으로 발판의 내부 및 외부 표면은 새로 분리된 골수 단핵 세포 분획을 접종합니다. 생물반응기는 18시간 동안 0.5 사이클/분의 초기 속도로 시작됩니다(그런 다음 단계적으로 최대 2.5 사이클/분까지 증가). 배양은 이식 절차 전 48시간 동안 이루어집니다. 이 인큐베이션 프로토콜은 세 가지 다른 합성 나노복합 기관 스캐폴드를 사용하는 이전 사례에서 매우 잘 작동했습니다.

재배 단계:

기관 재파종 절차는 설립되고 완벽하게 작동하는 무균 배양 GMP(Good Manufacturing Practice) 시설에서 수행됩니다.

1. 분리된 MNC는 골수 분리를 위한 Sepax 2 프로토콜에 따라 준비되고 0.9% 일반 식염수(10% 인간 알부민 포함)가 들어 있는 300ml 백에 재현탁됩니다.
2. 멸균된 스캐폴드(감마선 멸균), 바이오리액터(플라즈마 멸균) 및 수술 기구(오토클레이브)는 층류 후드에 배치됩니다.
3. 세포/생물반응기 및 스캐폴드를 조작하는 모든 사람은 GMP 등급 표준, 즉 멸균 장갑, 특정 작업복 등을 사용하도록 완전히 교육을 받습니다.
4. 생물 반응기는 멸균 상태에서 후드 내부에서 열리고 멸균 조직에 배치됩니다. 스캐폴드는 고정물을 고정하는 장기에 장착되고 생물 반응기에 배치됩니다. 스캐폴드가 바이오리액터로 옮겨지고 고정되면 MNC(+DMEM + 알부민 및 자가 혈장)가 스캐폴드 표면에 시드됩니다. 배지(자가 혈장 및 인간 알부민 포함)를 총 부피 200ml로 생물반응기 챔버에 추가합니다.
5. 인자는 배지에 추가됩니다: 39.3 ng/mL(100 nmol/L) 덱사메타손 및 10 μg/mL 인슐린.
6. 그런 다음 생물 반응기 챔버(스캐폴드, MNC + 200ml의 배지 포함)를 인큐베이터에 넣고 생물 반응기의 모터 유닛(이전에 인큐베이터 내부에 배치)에 장착합니다.
7. 생물반응기는 18시간 동안 0.5 사이클/분의 초기 속도로 시작됩니다(그런 다음 단계적으로 최대 2.5 사이클/분까지 증가).
8. 24시간 후, 추가 50ml의 앞서 언급한 배지가 챔버 내부의 총 부피 250ml에 추가됩니다. 이때 소량의 챔버 유체를 그람 염색으로 테스트하고 오염 여부를 확인하기 위해 배양 배지에 주입합니다.
9. 48시간 후 챔버를 열고 배양 및 그람 염색을 위해 분취량을 수확합니다. MTT 생존력 테스트를 위해 신기관의 작은 생검을 실시합니다. 세포가 생존 가능하고 배지 오염의 징후가 없는 것으로 확인되면(그람염색 및 직접 접종 배양의 중간 판독) 기관은 이식 준비가 된 것으로 간주되고 환자는 마취 상태에 놓이며 수술 절차가 진행됩니다. 시작했다.

이식일:

수술 중 수술 절차 이식 아침에 세포 성장에 대해 이식편을 테스트합니다(MTT 테스트 및 그람 염색에 의한 불임 및 중간 배양 결과 분석). 이식편이 이식 준비가 된 것으로 간주되면 환자는 전신 기관내 마취를 받게 됩니다.

흉부 및 복부 시술 기도의 손상된 부분을 절제한 후 기도 구조는 내부 표면의 호흡 세포 생검과 함께 수술 중 시딩됩니다. 그런 다음 이식편에 10 ng/mL의 재조합 인간 형질전환 성장 인자-β3, 10 nmol/L 재조합 부갑상선 호르몬 관련 펩타이드, 100 nmol/L 덱사메타손 및 10 μg/mL 인슐린을 포함한 성장 인자를 주입(컨디셔닝)합니다. , GCSF(10 μg/kg) 및 에리스로포이에틴(40,000 UI)(말초 조혈 세포의 동원을 자극하기 위해). 임플란트는 봉합사를 사용하여 기도 결함을 재건하기 위해 근위 및 원위로 문합됩니다. 그런 다음 omentum major flap(위의 큰 굽힘에서 분리된 지방 혈관 조직, 오른쪽 또는 왼쪽 위피플로 동맥에서 채취한 다음 횡격막 또는 흉골 아래 종격동으로 이월됨)으로 덮고 감싸서 이식편과 문합의 장기적인 보호를 보장하고 간접적인 이식편의 혈관신생을 얻습니다.

이식 후:

수술 후 치료

재생 과정을 촉진하기 위해 환자(현재 체중 약 13Kg)는 다음을 전신 주사하여 수술 후 기간에 약리학적으로 치료됩니다.

1. GCSF의 유사 재조합체(과립구, 1,000만 IU/kg에서 최대 3,000만 IU까지)
2. Erythropoietin의 유사 합성물(Epoetin 알파 또는 베타 40,000 IU)

두 인자 모두 조혈 세포의 동원/모집을 자극하기 위해 적절한 농도로 어떠한 부작용과도 관련되지 않은 "재생" 투여량으로 투여될 것입니다. 이틀마다 혈장 에리스로포이에틴 수치와 혈구 수(헤모글로빈 및 백혈구 수 포함)를 모니터링합니다. 15g/dl 이상의 헤모글로빈 수치는 고점도에 대한 우려를 일으키고 10-20cc/kg의 혈액을 즉시 제거하며 APTT(Activated Partial Thromboplastin Time) 수치를 40-60초. 50-60,000/μl 이상의 백혈구 수치는 "독성"으로 간주되며 수치가 30,000 미만으로 떨어질 때까지 GCSF 요법의 감소/중단을 초래할 것입니다. GCSF 및 에리트로포이에틴을 사용한 치료는 하기 표에 따라 이식 후 2주 동안 격일로 수행될 것이다:

후속 조치

후속 조치는 Krasnodar Regional Hospital의 심장 흉부 외과에서 수행되며 다음을 포함합니다.

1. 이식된 기도의 내시경 검사(유연성 및/또는 강성 기관지경 검사)는 첫 주 동안 매일, 두 번째 주에는 격일로, 그 후 처음 6개월 동안은 한 달에 한 번, 그 후 처음 5년 동안은 6개월마다 .
2. 처음 2주 동안 매일 백혈구 수식으로 혈구 수를 평가합니다.
3. 2주 동안 2일마다 말초 혈액으로부터 동원된 전구 세포의 평가.
4. 면역원성 평가. 이식 후 3일, 7일, 30일 후에 혈액 샘플을 채취하여 항체를 평가하여 조직 적합성을 연구합니다. 이식 후 3개월, 6개월, 12개월 후에 면역원성 추적조사도 실시할 예정이다.
5. 수술 후 토브라마이신 흡입(30일 동안 2x5ml/일)하여 폐렴 및 이식편 세균 오염을 예방합니다.
6. 이식된 기도의 3차원 재건과 함께 목과 가슴의 전산화 단층 촬영은 추시 1개월, 3개월, 6개월에 그리고 그 이후에는 처음 5년 동안 6개월마다 실시됩니다.