Laryngo-trakeal vävnadskonstruerad klinisk transplantation

Före transplantation kommer patienterna att ha laboratorie- och instrumentutvärderingar.

Tre dagar före transplantationen kommer patienten att genomgå benmärgsaspiration. De mononukleära benmärgscellerna (MNC) kommer att isoleras från de röda blodkropparna (RBC) i det helt slutna FDA-godkända automatiska systemet (Sepax, BioSafe America, Inc.). Den slutliga produkten, återsuspenderad med cellodlingsmedium (DMEM+10 % albumin och 10 % autolog plasma) i en volym av 200 ml, kommer att placeras i en 600 ml överföringspåse. 2 mL av produkten kommer att tas ur påsen före klinisk användning för att testa sterilitet med odlingsmedia och immunfluorescerande cytometri för att karakterisera celltyp och livsduglighet.

Två dagar före transplantationen kommer patienten att börja "boostande" terapi för att mobilisera celler med hjälp av systemiska injektioner av analoga rekombinanter av granulocytkolonistimulerande faktor (GCSF) (Granocyt, 1 M IE/kg (max. 15 M IE) och erytropoietin, 400 IE/kg (max. 6 000 IE). Dessa kommer att injiceras under de två dagarna före operationen.

InBreath Bioreactor (den speciella bioreaktorn för odling av luftstrupe) Arbetet i det nuvarande protokollet kommer att involvera en bioreaktordesign som tidigare använts av Macchiarini P. ang college i en framgångsrik första-i-människ-implantation av en vävnadskonstruerad ersättning för stora luftvägar. Enheten, som kommersialiseras under namnet InBreath 3D Organ Bioreactor (Harvard Bioscience, Inc.) är designad för placering i en vävnadskulturinkubator och består av en modulär polysulfonorgankammare, motorenhet och fjärrkontroll. Kammaren är lätt att ta bort från motorenheten och dess polysulfonkonstruktion tillåter sterilisering med standardgasplasmasteriliseringsprocessen som är lätt tillgänglig i operationssalen i Peoria. Motorenheten ger konsekvent rotation till vävnadshållaren i kammaren, vilket säkerställer kontrollerad applicering av hydrodynamiska skjuvkrafter på den utvecklande trakealkonstruktionen. Ett helt slutet motorhus skyddar den borstlösa motorn från den frätande fukten i inkubatorn. Fjärrkontrollenheten är placerad utanför inkubatorn och ger ett sätt att justera rotationshastigheten utan att störa inkubatorns miljö.

Den ympade konstruktionen fick inkuberas i bioreaktorn under 96 timmar innan den avlägsnades för implantation. Baserat på de fem tidigare vuxna fallen med användning av POSS-PCU (Polyhedral oligomer silsesquioxane-poly(karbonat-urea) uretan), PET (Polyetylentereftalat) och PET:PU (Polyuretan) syntetiska ställningar, kommer de inre och yttre ytorna på ställningen att sådd med den nyligen isolerade mononukleära cellfraktionen i benmärg. Bioreaktorn kommer att startas med en initial hastighet på 0,5 cykler/min under 18 timmar (öka sedan stegvis upp till 2,5 cykler/min). Inkubationen kommer att ske under de 48 timmarna före transplantationen. Detta inkubationsprotokoll fungerade mycket bra i de tidigare fallen med de tre olika syntetiska nanokomposit trakeal ställningarna.

Odlingssteg:

Trakealåtersåddproceduren kommer att göras i vår aseptiska odlingsanläggning GMP (Good Manufacturing Practice) som etablerades och fungerar fullt ut.

1. Isolerad MNC kommer att beredas enligt Sepax 2-protokollet för benmärgsseparering och återsuspenderas i en 300 ml påse innehållande 0,9 % normal saltlösning (med 10 % humant albumin).
2. Den steriliserade ställningen (sterilisering med gammastrålning), bioreaktorn (plasmaserilisering) och kirurgiska instrument (autoklaverade) kommer att placeras i den laminära huven.
3. Alla personer som manipulerar cellerna/bioreaktorn och ställningen kommer att vara fullt utbildade i att ha GMP-standarder, nämligen sterila handskar, specifika overaller, etc.
4. Bioreaktorn kommer att öppnas inuti huven under sterila förhållanden och placeras på en steril vävnad. Ställningen kommer att monteras på organhållarens fixturer och placeras i bioreaktorn. När ställningen har överförts och fixerats i bioreaktorn kommer MNC (+DMEM plus albumin och autolog plasma) att ympas på ställningens yta. Medium (inklusive autolog plasma och humant albumin) kommer att tillsättas till bioreaktorkammaren till en total volym av 200 ml.
5. Faktorerna kommer att lägga till medium: 39,3 ng/mL (100 nmol/L) dexametason och 10 μg/ml insulin.
6. Därefter kommer bioreaktorkammaren (inklusive ställningen, MNC + 200 ml medium) att placeras i inkubatorn och monteras på bioreaktorns motorenhet (tidigare placerad inuti inkubatorn).
7. Bioreaktorn kommer att startas med en initial hastighet på 0,5 cykler/min i 18 timmar (öka sedan stegvis upp till 2,5 cykler/min).
8. Efter 24 timmar kommer ytterligare 50 ml av det förutnämnda mediet att tillsättas till en total volym på 250 ml inuti kammaren. Vid denna tidpunkt kommer en liten alikvot kammarvätska att testas med gramfärgning och injiceras i odlingsmedia för att kontrollera kontaminering.
9. Efter 48 timmar kommer kammaren att öppnas och en alikvot skördas för odling och gramfärgning. En liten biopsi av neotrakea kommer att tas för MTT-viabilitetstestet. När det väl har fastställts att cellerna är livsdugliga och det inte finns några tecken på mediakontamination (gramfärgning och interimsavläsning av direkt inokuleringskultur) kommer luftstrupen att anses redo för implantation och patienten kommer att placeras under narkos och det kirurgiska ingreppet kommer att utföras. satte igång.

Dag för transplantation:

Intraoperativ kirurgisk procedur På morgonen för transplantationen kommer transplantatet att testas för celltillväxt (MTT-test och för sterilitet genom gramfärgning och analys av interimistiska odlingsresultat). När transplantatet bedöms vara redo för implantation kommer patienten att placeras under allmän endotrakeal anestesi.

Thorax- och bukprocedurer Efter att ha utfört resektion av luftvägens skadade segment, kommer luftvägskonstruktionen att ympas intraoperativt med respiratoriska cellbiopsier på den inre ytan. Transplantatet kommer sedan att injiceras (konditioneras) med tillväxtfaktorer inklusive 10 ng/ml rekombinant human transformerande tillväxtfaktor-β 3, 10 nmol/L rekombinant bisköldkörtelhormonrelaterad peptid, 100 nmol/L dexametason och 10 µg/ml insulin GCSF (10 µg/kg) och erytropoietin (40 000 UI) (för att stimulera mobiliseringen av de perifera hematopoetiska cellerna). Implantatet kommer sedan att anastomeras proximalt och distalt för att rekonstruera luftvägsdefekten med hjälp av suturer. Den kommer sedan att täckas och lindas med en omentum major-flik (fettkärlvävnad som lossnar från den stora böjningen av magen, skördas på höger eller vänster gastroepiploisk artär och sedan förs över till mediastinum trans-diafragmatiskt eller sub-sternalt), för att garanterar långvarigt skydd av transplantatet och anastomosen och erhåller indirekt transplantats neovaskularisering.

Efter transplantation:

Postoperativ behandling

För att stärka den regenerativa processen kommer patienten (nuvarande vikt ca 13 kg) att behandlas farmakologiskt under postoperationen med systemiska injektioner av:

1. Analoga rekombinanter av GCSF (Granocyte, 10 miljoner IE/kg upp till maximalt 30 miljoner IE)
2. Analoga synteser av erytropoietin (Epoetin alfa eller beta 40 000 IE)

Båda faktorerna kommer att administreras i lämpliga koncentrationer för att stimulera mobiliseringen/rekryteringen av hematopoetiska celler, i "regenerativa" doser som inte har associerats med några biverkningar. Varannan dag kommer plasmanivån av erytropoietin och blodbilden (inklusive hemoglobin och vita blodkroppar) att övervakas. Hemoglobinnivåer över 15 g/dl kommer att ge upphov till oro för hyperviskositet och snabbt avlägsnande av 10-20 cc/kg blod och kan leda till tillsats av en kontinuerlig infusion av heparin för att hålla APTT-nivåerna (aktiverad partiell tromboplastintid) mellan 40-60 sekunder. Nivåer av vita blodkroppar över 50-60 000/μl kommer att betraktas som "toxiska" och kommer att resultera i en minskning/avstängning av GCSF-behandlingen tills antalet faller under 30 000. Behandling med GCSF och erytropoietin kommer att utföras varannan dag i 2 veckor efter transplantationen enligt följande tabell:

Uppföljning

Uppföljningen kommer att utföras på hjärtkirurgiska avdelningen på Krasnodars regionsjukhus och kommer att omfatta:

1. Endoskopisk utvärdering (flexibel och/eller stel bronkoskopi) av de transplanterade luftvägarna varje dag under den första veckan och varannan dag under den andra veckan, därefter en gång i månaden under de första sex månaderna och var 6:e ​​månad därefter under de första 5 åren .
2. Utvärdering av blodvärdet med formeln för vita blodkroppar dagligen under de första två veckorna.
3. Utvärdering av mobiliserade progenitorceller från perifert blod varannan dag under 2 veckor.
4. Immunogen utvärdering. Efter 3, 7 och 30 dagar från transplantationen kommer ett blodprov att tas för att göra en studie av histokompatibiliteten genom att utvärdera antikropparna. Den immunogena uppföljningen kommer också att utföras efter 3, 6 och 12 månader från transplantationen.
5. Postoperativ tobramycininhalation (2x5ml/dag i 30 dagar) för att förhindra lunginflammation och transplantatbakteriekontamination.
6. Datortomografi av nacke och bröstkorg med en tredimensionell rekonstruktion av den transplanterade luftvägen kommer att göras vid månad 1, månad 3 och månad 6 av uppföljningen, och var 6:e ​​månad därefter under de första 5 åren.