Laryngo-tracheal væv-manipuleret klinisk transplantation

Før transplantation vil patienterne have laboratorie- og instrumentevalueringer.

Tre dage før transplantationen vil patienten blive gennemgået knoglemarvsaspiration. De mononukleære knoglemarvsceller (MNC) vil blive isoleret fra de røde blodlegemer (RBC) i det fuldstændigt lukkede FDA-godkendte automatiske system (Sepax, BioSafe America, Inc.). Slutproduktet, resuspenderet med cellekulturmedium (DMEM+10% albumin og 10% autologt plasma) i et volumen på 200 ml, vil blive anbragt i en 600 ml overførselspose. 2 mL af produktet vil blive taget fra posen før klinisk brug for at teste sterilitet ved hjælp af dyrkningsmedier og immunfluorescerende cytometri for at karakterisere celletype og levedygtighed.

To dage før transplantationen vil patienten begynde at "booste" terapi for at mobilisere celler ved hjælp af systemiske injektioner af analoge rekombinanter af granulocytkolonistimulerende faktor (GCSF) (Granocyt, 1 M IE/kg (max. 15 M IE) og Erythropoietin, 400 IE/kg (maks. 6.000 IE). Disse vil blive injiceret i de to dage før operationen.

InBreath Bioreactor (den specielle bioreaktor til dyrkning af luftrør) Arbejdet i den nuværende protokol vil involvere et bioreaktordesign, der tidligere blev brugt af Macchiarini P. ang colleges i en vellykket first-in-man implantation af en vævsmanipuleret store luftvejserstatning. Enheden, der kommercialiseret under navnet, InBreath 3D Organ Bioreactor (Harvard Bioscience, Inc.) er designet til placering i en vævskulturinkubator og består af et modulært polysulfon-organkammer, motorenhed og fjernbetjening. Kammeret er let aftageligt fra motorenheden, og dets polysulfonkonstruktion tillader sterilisering med standardgasplasmaseriliseringsprocessen, der er let tilgængelig i operationsstuen i Peoria. Motorenheden giver konsekvent rotation til vævsholderen i kammeret, hvilket sikrer kontrolleret påføring af hydrodynamiske forskydningskræfter på den udviklende trakeale konstruktion. Et fuldt lukket motorhus beskytter den børsteløse motor mod den ætsende fugt i inkubatoren. Fjernbetjeningsenheden er placeret uden for inkubatoren og giver mulighed for at justere rotationshastigheden uden at forstyrre inkubatormiljøet.

Den podede konstruktion fik lov til at inkubere i bioreaktoren i 96 timer før fjernelse til implantation. Baseret på de fem tidligere voksne tilfælde, hvor der blev brugt POSS-PCU (Polyhedral oligomer silsesquioxane-poly(carbonat-urea) urethan), PET(Polyethylenterephthalat) og PET:PU (Polyurethan) syntetiske stilladser, vil de indvendige og udvendige overflader af stilladset blive podet med den frisk isolerede mononukleære cellefraktion af knoglemarv. Bioreaktoren vil blive startet med en begyndelseshastighed på 0,5 cyklusser/min i 18 timer (forøg derefter trinvis op til 2,5 cyklusser/min). Inkubation vil finde sted i de 48 timer forud for transplantationsproceduren. Denne inkubationsprotokol fungerede meget godt i de tidligere tilfælde ved brug af de tre forskellige syntetiske nanokomposit tracheal stilladser.

Dyrkningstrin:

Tracheal gensåningsproceduren vil blive udført i vores aseptiske kultur GMP (Good Manufacturing Practice) facilitet, der var etableret og fuldt funktionsdygtigt.

1. Isoleret MNC vil blive fremstillet i henhold til Sepax 2-protokollen til knoglemarvsseparation og resuspenderet i en 300 ml pose indeholdende 0,9 % normal saltvandsopløsning (med 10 % humant albumin).
2. Det steriliserede stillads (gammabestrålingssterilisering), bioreaktoren (plasmaserilisering) og kirurgiske instrumenter (autoklaveret) vil blive placeret i den laminære hætte.
3. Alle personer, der manipulerer cellerne/bioreaktoren og stilladset, vil være fuldt uddannet i at have GMP-standarder, nemlig sterile handsker, specifikke overalls osv.
4. Bioreaktoren åbnes inde i emhætten under sterile forhold og placeres på et sterilt væv. Stilladset vil blive monteret på organholdere og placeret i bioreaktoren. Når stilladset er overført og fikseret i bioreaktoren, vil MNC (+DMEM plus albumin og autologt plasma) blive podet på stilladsets overflade. Medium (inklusive autologt plasma og humant albumin) vil blive tilsat til bioreaktorkammeret til et samlet volumen på 200 ml.
5. Faktorerne vil tilføje til mediet: 39,3 ng/mL (100 nmol/L) dexamethason og 10 μg/ml insulin.
6. Derefter placeres bioreaktorkammeret (inklusive stilladset, MNC + 200 ml medium) i inkubatoren og monteres på bioreaktorens motorenhed (tidligere placeret inde i inkubatoren).
7. Bioreaktoren vil blive startet med en starthastighed på 0,5 cyklus/minut i 18 timer (forøg derefter trinvis op til 2,5 cyklusser/minut).
8. Efter 24 timer tilsættes yderligere 50 ml af det forudnævnte medium til et samlet volumen på 250 ml inde i kammeret. På dette tidspunkt vil en lille alikvot af kammervæske blive testet med gramfarvning og injiceret i dyrkningsmedier for at kontrollere for kontaminering.
9. Efter 48 timer vil kammeret blive åbnet, og en alikvot vil blive høstet til dyrkning og Gram-farvning. En lille biopsi af neotrachea vil blive taget til MTT-levedygtighedstesten. Når det er fastslået, at cellerne er levedygtige, og der ikke er tegn på mediekontamination (Gram-farvning og midlertidig aflæsning af direkte podningskultur), vil luftrøret blive anset for klar til implantation, og patienten vil blive lagt under bedøvelse, og den kirurgiske procedure vil blive startede.

Dag for transplantation:

Intraoperativ kirurgisk procedure Morgenen for transplantationen vil transplantatet blive testet for cellevækst (MTT-test og for sterilitet ved gramfarvning og analyse af interim-kulturresultater). Når transplantatet anses for klar til implantation, vil patienten blive anbragt under generel endotrakeal anæstesi.

Thoracale og abdominale procedurer Efter at have udført resektion af luftvejens beskadigede segment, vil luftvejskonstruktionen blive podet intraoperativt med respiratoriske cellebiopsier på den indre overflade. Graftet vil derefter blive injiceret (konditioneret) med vækstfaktorer, herunder 10 ng/ml rekombinant human transformerende vækstfaktor-β 3, 10 nmol/L rekombinant parathyroidhormon-relateret peptid, 100 nmol/L dexamethason og 10 µg/ml insulin , GCSF (10 µg/kg) og Erythropoietin (40.000 UI) (for at stimulere mobiliseringen af ​​de perifere hæmatopoietiske celler). Implantatet anastomeres derefter proksimalt og distalt for at rekonstruere luftvejsdefekten ved hjælp af suturer. Det vil derefter blive dækket og pakket ind af en omentum major-klap (fedtvaskulariseret væv løsnet fra den store bøjning af maven, høstet på højre eller venstre gastroepiploiske arterie og derefter ført over til mediastinum trans-diaphragmatisk eller sub-sternalt), for at garantere langtidsbeskyttelse af transplantatet og anastomosen og opnå indirekte transplantatets neovaskularisering.

Efter transplantation:

Postoperativ behandling

For at booste den regenerative proces vil patienten (nuværende vægt ca. 13 kg) blive behandlet farmakologisk i post-operationsperioden med systemiske injektioner af:

1. Analoge rekombinanter af GCSF (Granocyte, 10 millioner IE/kg op til et maksimum på 30 millioner IE)
2. Analoge synteser af erytropoietin (Epoetin alfa eller beta 40.000 IE)

Begge faktorer vil blive indgivet i passende koncentrationer for at stimulere mobilisering/rekruttering af hæmatopoietiske celler i "regenerative" doser, som ikke har været forbundet med nogen bivirkninger. Hver anden dag vil plasmaniveauet af erythropoietin og blodtællingen (inklusive hæmoglobin og hvide blodlegemer) blive overvåget. Hæmoglobinniveauer på over 15 g/dl vil give anledning til bekymring for hyperviskositet og hurtig fjernelse af 10-20 cc/kg blod og kan medføre tilsætning af en kontinuerlig infusion af heparin for at holde de aktiverede partielle tromboplastintider (APTT) mellem 40-60 sekunder. Niveauer af hvide blodlegemer over 50-60.000/μl vil blive betragtet som "toksiske" og vil resultere i en reduktion/suspension af GCSF-behandlingen, indtil antallet falder til under 30.000. Behandling med GCSF og Erythropoietin vil blive udført hver anden dag i 2 uger efter transplantationen i henhold til følgende tabel:

Opfølgning

Opfølgningen vil blive udført på hjerte-thoraxkirurgisk afdeling på Krasnodar Regional Hospital og vil omfatte:

1. Endoskopisk evaluering (fleksibel og/eller rigid bronkoskopi) af de transplanterede luftveje hver dag i den første uge og hver anden dag i den anden uge, hvorefter en gang om måneden i de første seks måneder, og hver 6. måned derefter i de første 5 år .
2. Evaluering af blodtallet med hvide blodlegemer dagligt i de første to uger.
3. Evaluering af mobiliserede progenitorceller fra perifert blod hver anden dag i 2 uger.
4. Immunogen evaluering. Efter 3, 7 og 30 dage efter transplantationen vil der blive taget en blodprøve for at lave en undersøgelse af histokompatibiliteten ved at evaluere antistofferne. Den immunogene opfølgning vil også blive udført efter 3, 6 og 12 måneder fra transplantationen.
5. Postoperativ Tobramycin-inhalation (2x5ml/dag i 30 dage) for at forhindre lungebetændelse og transplantatbakteriekontamination.
6. Computertomografi af hals og bryst med en tredimensionel rekonstruktion af de transplanterede luftveje vil blive udført i måned 1, måned 3 og måned 6 af opfølgningen, og hver 6. måned derefter i de første 5 år.