Laryngo-tracheale weefsel-gemanipuleerde klinische transplantatie

Vóór transplantatie zullen de patiënten laboratorium- en instrumentele evaluaties ondergaan.

Drie dagen voor de transplantatie krijgt de patiënt een beenmergpunctie. De mononucleaire cellen van het beenmerg (MNC) zullen worden geïsoleerd van de rode bloedcellen (RBC) in het volledig gesloten, door de FDA goedgekeurde automatische systeem (Sepax, BioSafe America, Inc.). Het eindproduct, opnieuw gesuspendeerd met celkweekmedium (DMEM+10% albumine en 10% autoloog plasma) in een volume van 200 ml, wordt in een transferzak van 600 ml geplaatst. Vóór klinisch gebruik wordt 2 ml van het product uit de zak gehaald om de steriliteit te testen met behulp van kweekmedia en immunofluorescente cytometrie om het celtype en de levensvatbaarheid te karakteriseren.

Twee dagen voor de transplantatie begint de patiënt met het "boosten" van de therapie om cellen te mobiliseren door middel van systemische injecties van analoge recombinanten van granulocytkoloniestimulerende factor (GCSF) (Granocyte, 1 M IU/kg (max. 15 miljoen IE) en erytropoëtine, 400 IE/kg (max. 6.000 IE). Deze worden de twee dagen voorafgaand aan de operatie geïnjecteerd.

InBreath Bioreactor (de speciale bioreactor voor het cultiveren van luchtpijp) Het werk in het huidige protocol omvat een bioreactorontwerp dat eerder werd gebruikt door Macchiarini P. ang hogescholen in een succesvolle first-in-man implantatie van een weefsel-gemanipuleerde grote luchtwegvervanging. Het apparaat, gecommercialiseerd onder de naam InBreath 3D Organ Bioreactor (Harvard Bioscience, Inc.) is ontworpen voor plaatsing in een weefselkweekincubator en bestaat uit een modulaire polysulfon-orgaankamer, motoreenheid en afstandsbediening. De kamer is eenvoudig los te koppelen van de motoreenheid en de polysulfonconstructie maakt sterilisatie mogelijk met het standaard gasplasmasterilisatieproces dat direct beschikbaar is in de operatiekamer in Peoria. De motoreenheid zorgt voor een consistente rotatie van de weefselhouder in de kamer, waardoor een gecontroleerde toepassing van hydrodynamische schuifkrachten op de zich ontwikkelende tracheale constructie wordt gegarandeerd. Een volledig gesloten motorbehuizing beschermt de borstelloze motor tegen het corrosieve vocht in de broedmachine. De afstandsbediening wordt buiten de couveuse geplaatst en biedt een middel om de rotatiesnelheid aan te passen zonder de omgeving van de couveuse te verstoren.

Het geënte construct mocht 96 uur in de bioreactor incuberen voorafgaand aan verwijdering voor implantatie. Gebaseerd op de vijf eerdere gevallen bij volwassenen waarbij gebruik werd gemaakt van de POSS-PCU (polyhedrale oligomere silsesquioxaan-poly(carbonaat-ureum)urethaan), PET(polyethyleentereftalaat) en PET:PU (polyurethaan) synthetische steigers, zullen de interne en externe oppervlakken van de steiger worden geënt met de vers geïsoleerde beenmerg mononucleaire celfractie. De bioreactor wordt gestart met een beginsnelheid van 0,5 cycli/min gedurende 18 uur (vervolgens stapsgewijs verhogen tot 2,5 cycli/min). Incubatie vindt plaats gedurende de 48 uur voorafgaand aan de transplantatieprocedure. Dit incubatieprotocol werkte heel goed in de vorige gevallen met behulp van de drie verschillende synthetische nanocomposiet tracheale steigers.

Teelt stappen:

De procedure voor het opnieuw inzaaien van de trachea zal worden uitgevoerd in onze GMP-faciliteit (Good Manufacturing Practice) voor aseptische kweek die is opgericht en volledig functioneel is.

1. Geïsoleerde MNC wordt bereid volgens het Sepax 2-protocol voor beenmergscheiding en opnieuw gesuspendeerd in een zak van 300 ml met 0,9% normale zoutoplossing (met 10% humaan albumine).
2. De gesteriliseerde steiger (sterilisatie met gammastraling), de bioreactor (sterilisatie met plasma) en de chirurgische instrumenten (geautoclaveerd) worden in de laminaire kap geplaatst.
3. Alle personen die de cellen/bioreactor en steiger manipuleren, zullen volledig zijn opgeleid in GMP-normen, namelijk steriele handschoenen, specifieke overalls, enz.
4. De bioreactor wordt in de kap in steriele omstandigheden geopend en op een steriel weefsel geplaatst. De steiger wordt op de orgelhouders gemonteerd en in de bioreactor geplaatst. Zodra de steiger is overgebracht en in de bioreactor is gefixeerd, wordt de MNC (+ DMEM plus albumine en autoloog plasma) op het oppervlak van de steiger gezaaid. Medium (inclusief autoloog plasma en humaan albumine) wordt aan de bioreactorkamer toegevoegd tot een totaal volume van 200 ml.
5. De factoren zullen optellen tot medium: 39,3 ng/ml (100 nmol/l) dexamethason en 10 μg/ml insuline.
6. Vervolgens wordt de bioreactorkamer (inclusief de scaffold, MNC + 200 ml medium) in de incubator geplaatst en op de motorunit van de bioreactor gemonteerd (eerder in de incubator geplaatst).
7. De bioreactor wordt gestart met een initiële snelheid van 0,5 cyclus/min gedurende 18 uur (vervolgens stapsgewijs verhogen tot 2,5 cycli/min).
8. Na 24 uur wordt nog eens 50 ml van het bovengenoemde medium toegevoegd tot een totaal volume van 250 ml in de kamer. Op dit moment wordt een klein deel van de kamervloeistof getest met gramkleuring en geïnjecteerd in kweekmedia om te controleren op verontreiniging.
9. Na 48 uur wordt de kamer geopend en wordt een aliquot geoogst voor kweek en gramkleuring. Er zal een kleine biopsie van de neotrachea worden genomen voor de MTT-levensvatbaarheidstest. Zodra is vastgesteld dat de cellen levensvatbaar zijn en er geen teken van mediabesmetting is (Gramkleuring en tussentijdse aflezing van directe inentingscultuur), wordt de luchtpijp geacht klaar te zijn voor implantatie en wordt de patiënt onder narcose gebracht en wordt de chirurgische ingreep uitgevoerd. begonnen.

Dag van transplantatie:

Intra-operatieve chirurgische procedure De ochtend van de transplantatie wordt het transplantaat getest op celgroei (MTT-test en op steriliteit door middel van gramkleuring en analyse van tussentijdse kweekresultaten). Zodra het transplantaat gereed wordt geacht voor implantatie, wordt de patiënt onder algemene endotracheale anesthesie geplaatst.

Thoracale en abdominale procedures Nadat de resectie van het beschadigde segment van de luchtweg is uitgevoerd, wordt de luchtwegconstructie intraoperatief geënt met de respiratoire celbiopten op het inwendige oppervlak. Het transplantaat wordt vervolgens geïnjecteerd (geconditioneerd) met groeifactoren, waaronder 10 ng/ml recombinant humane transformerende groeifactor-β3, 10 nmol/L recombinant parathyroïdhormoon-gerelateerd peptide, 100 nmol/L dexamethason en 10 µg/ml insuline , GCSF (10 µg/kg) en erytropoëtine (40.000 UI) (om de mobilisatie van de perifere hematopoëtische cellen te stimuleren). Het implantaat wordt vervolgens proximaal en distaal geanastomoseerd om het luchtwegdefect met behulp van hechtingen te reconstrueren. Het wordt vervolgens bedekt en omwikkeld door een omentum major flap (vet gevasculariseerd weefsel losgemaakt van de grote bocht van de maag, geoogst op de rechter of linker gastro-epiploïsche slagader en vervolgens transdiafragmatisch of substernaal naar het mediastinum overgebracht), om garanderen langdurige bescherming van het transplantaat en van de anastomose en verkrijgen indirecte neovascularisatie van het transplantaat.

Na transplantatie:

Postoperatieve behandeling

Om het regeneratieve proces te stimuleren, zal de patiënt (huidig ​​gewicht ongeveer 13 kg) in de postoperatieve periode farmacologisch worden behandeld door middel van systemische injecties van:

1. Analoge recombinanten van GCSF (Granocyte, 10 miljoen IE/kg tot maximaal 30 miljoen IE)
2. Analoge synthetische stoffen van erytropoëtine (epoëtine alfa of bèta 40.000 IE)

Beide factoren zullen worden toegediend in geschikte concentraties om de mobilisatie/rekrutering van hematopoëtische cellen te stimuleren, in "regeneratieve" doses die niet in verband zijn gebracht met bijwerkingen. Elke tweede dag worden de erytropoëtinespiegel in plasma en het aantal bloedcellen (inclusief het aantal hemoglobine en witte bloedcellen) gecontroleerd. Hemoglobinewaarden hoger dan 15 g/dl geven aanleiding tot bezorgdheid over hyperviscositeit en snelle verwijdering van 10-20 cc/kg bloed en kunnen aanleiding geven tot de toevoeging van een continue infusie van heparine om de geactiveerde partiële tromboplastinetijd (APTT)-waarden tussen 40-60 seconden. Witte bloedcellen boven 50-60.000/μl zullen als "toxisch" worden beschouwd en zullen resulteren in een vermindering/opschorting van de GCSF-therapie totdat het aantal onder de 30.000 daalt. De behandeling met GCSF en erytropoëtine wordt gedurende 2 weken na de transplantatie om de dag uitgevoerd volgens de volgende tabel:

Opvolgen

De follow-up zal worden uitgevoerd op de afdeling Cardiothoracale Chirurgie van het Krasnodar Regional Hospital en omvat:

1. Endoscopische evaluatie (flexibele en/of rigide bronchoscopie) van de getransplanteerde luchtweg elke dag gedurende de eerste week en om de dag gedurende de tweede week, daarna eenmaal per maand gedurende de eerste zes maanden, en daarna elke 6 maanden gedurende de eerste 5 jaar .
2. Evaluatie van het bloedbeeld met formule voor witte bloedcellen dagelijks gedurende de eerste twee weken.
3. Evaluatie van gemobiliseerde voorlopercellen uit perifeer bloed om de twee dagen gedurende 2 weken.
4. Immunogene evaluatie. Na 3, 7 en 30 dagen na de transplantatie zal een bloedmonster worden genomen om de histocompatibiliteit te bestuderen door de antilichamen te evalueren. De immunogene follow-up vindt ook plaats na 3, 6 en 12 maanden na de transplantatie.
5. Postoperatieve tobramycine-inhalatie (2 x 5 ml/dag gedurende 30 dagen) om longontsteking en transplantaatbacteriële besmetting te voorkomen.
6. Geautomatiseerde tomografie van de nek en borst met een driedimensionale reconstructie van de getransplanteerde luchtweg zal worden uitgevoerd op maand 1, maand 3 en maand 6 van de follow-up, en daarna elke 6 maanden gedurende de eerste 5 jaar.