Laryngo-trakeal vev-utviklet klinisk transplantasjon

Før transplantasjon vil pasientene ha laboratorie- og instrumentevalueringer.

Tre dager før transplantasjonen skal pasienten gjennomgå benmargsaspirasjon. De mononukleære benmargscellene (MNC) vil bli isolert fra de røde blodcellene (RBC) i det fullstendig lukkede FDA-godkjente automatiske systemet (Sepax, BioSafe America, Inc.). Sluttproduktet, resuspendert med cellekulturmedium (DMEM+10 % albumin og 10 % autologt plasma) i et volum på 200 mL, vil bli plassert i en 600 mL overføringspose. 2 mL av produktet tas fra posen før klinisk bruk for å teste sterilitet ved bruk av kulturmedier og immunfluorescerende cytometri for å karakterisere celletype og levedyktighet.

To dager før transplantasjonen vil pasienten begynne "booster"-terapi for å mobilisere celler ved hjelp av systemiske injeksjoner av analoge rekombinanter av granulocyttkolonistimulerende faktor (GCSF) (Granocytt, 1 M IE/kg (maks. 15 M IE) og erytropoietin, 400 IE/kg (maks. 6 000 IE). Disse vil bli injisert i de to dagene før operasjonen.

InBreath Bioreactor (den spesielle bioreaktoren for dyrking av luftrør) Arbeidet i den nåværende protokollen vil involvere et bioreaktordesign som tidligere ble brukt av Macchiarini P. ang høyskoler i en vellykket første-i-mann-implantasjon av en vevskonstruert erstatning for store luftveier. Enheten, kommersialisert under navnet InBreath 3D Organ Bioreactor (Harvard Bioscience, Inc.) er designet for plassering i en vevskulturinkubator og består av et modulært polysulfonorgankammer, motorenhet og fjernkontroll. Kammeret kan enkelt tas av motorenheten og polysulfonkonstruksjonen tillater sterilisering med standard gassplasmaseriliseringsprosess som er lett tilgjengelig på operasjonssalen i Peoria. Motorenheten gir konsistent rotasjon til vevsholderen i kammeret, og sikrer kontrollert påføring av hydrodynamiske skjærkrefter på den utviklende trakealkonstruksjonen. Et helt lukket motorhus beskytter den børsteløse motoren mot den korrosive fuktigheten i inkubatoren. Fjernkontrollenheten er plassert utenfor inkubatoren og gir mulighet for å justere rotasjonshastigheten uten å forstyrre inkubatormiljøet.

Den sådde konstruksjonen ble tillatt å inkubere i bioreaktoren i 96 timer før fjerning for implantasjon. Basert på de fem tidligere voksentilfellene med bruk av POSS-PCU (Polyhedral oligomer silsesquioxane-poly(carbonate-urea) urethane), PET(Polyetylentereftalat) og PET:PU (Polyuretan) syntetiske stillaser, vil de indre og ytre overflatene av stillaset bli sådd med den nyisolerte mononukleære cellefraksjonen av benmarg. Bioreaktoren vil startes med en starthastighet på 0,5 sykluser/min i 18 timer (øk deretter trinnvis opp til 2,5 sykluser/min). Inkubasjonen vil foregå i løpet av 48 timer før transplantasjonsprosedyren. Denne inkubasjonsprotokollen fungerte veldig bra i de tidligere tilfellene ved å bruke de tre forskjellige syntetiske nanokompositt trakealstillasene.

Kultiveringstrinn:

Trakeal reseeding prosedyren vil bli utført i vår aseptiske kultur GMP (Good Manufacturing Practice) anlegget som ble etablert og fullt funksjonelt.

1. Isolert MNC vil bli tilberedt i henhold til Sepax 2-protokollen for benmargsseparasjon og resuspendert i en 300 ml pose som inneholder 0,9 % normal saltvannsløsning (med 10 % humant albumin).
2. Det steriliserte stillaset (gammabestrålingssterilisering), bioreaktoren (plasmaserilisering) og kirurgiske instrumenter (autoklaveret) vil bli plassert i den laminære hetten.
3. Alle personer som manipulerer cellene/bioreaktoren og stillaset vil være fullt opplært i å ha GMP-standarder, nemlig sterile hansker, spesifikke kjeledresser, etc.
4. Bioreaktoren vil bli åpnet inne i panseret under sterile forhold og plassert på et sterilt vev. Stillaset vil bli montert på organholdere og plassert i bioreaktoren. Når stillaset er overført og festet til bioreaktoren, vil MNC (+DMEM pluss albumin og autologt plasma) sees på stillasets overflate. Medium (inkludert autologt plasma og humant albumin) vil bli tilsatt til bioreaktorkammeret til et totalt volum på 200 ml.
5. Faktorene vil legge til medium: 39,3 ng/mL (100 nmol/L) deksametason og 10 μg/ml insulin.
6. Deretter vil bioreaktorkammeret (inkludert stillaset, MNC + 200 ml medium) plasseres i inkubatoren og monteres på motorenheten til bioreaktoren (tidligere plassert inne i inkubatoren).
7. Bioreaktoren vil startes med en starthastighet på 0,5 syklus/min i 18 timer (øk deretter trinnvis opp til 2,5 sykluser/min).
8. Etter 24 timer vil ytterligere 50 ml av det forhåndsnevnte mediet tilsettes til et totalt volum på 250 ml inne i kammeret. På dette tidspunktet vil en liten aliquot av kammervæske bli testet med gramfarging og injisert i kulturmedier for å sjekke for kontaminering.
9. Etter 48 timer vil kammeret åpnes og en alikvot høstes for kultur og Gram-farging. En liten biopsi av neotrachea vil bli tatt for MTT-levedyktighetstesten. Når det er fastslått at cellene er levedyktige og det ikke er tegn til medieforurensning (Gramfarging og midlertidig avlesning av direkte inokulasjonskultur), vil luftrøret anses som klar for implantasjon og pasienten vil bli lagt under anestesi og den kirurgiske prosedyren vil bli startet.

Dag for transplantasjon:

Intraoperativ kirurgisk prosedyre Morgenen for transplantasjonen vil transplantatet bli testet for cellevekst (MTT-test og for sterilitet ved gramfarging og analyse av interimkulturresultater). Når transplantatet anses klar for implantasjon, vil pasienten bli plassert under generell endotrakeal anestesi.

Thoracale og abdominale prosedyrer Etter å ha utført reseksjon av luftveiens skadede segment, vil luftveiskonstruksjonen sees intraoperativt med respirasjonscellebiopsiene på den indre overflaten. Graftet vil deretter bli injisert (kondisjonert) med vekstfaktorer inkludert 10 ng/ml rekombinant human transformerende vekstfaktor-β 3, 10 nmol/L rekombinant parathyroidhormonrelatert peptid, 100 nmol/L deksametason og 10 µg/ml insulin , GCSF (10 µg/kg) og erytropoietin (40 000 UI) (for å stimulere mobiliseringen av de perifere hematopoietiske cellene). Implantatet vil deretter bli anastomert proksimalt og distalt for å rekonstruere luftveisdefekten ved bruk av suturer. Den vil deretter dekkes og pakkes inn av en omentum major klaff (fettvaskularisert vev løsnet fra den store bøyningen av magen, høstet på høyre eller venstre gastroepiploisk arterie og deretter ført over til mediastinum trans-diaphragmatisk eller sub-sternalt), for å garantere langsiktig beskyttelse av transplantatet og anastomosen og oppnå indirekte transplantatets neovaskularisering.

Etter transplantasjon:

Postoperativ behandling

For å øke den regenerative prosessen, vil pasienten (nåværende vekt ca. 13 kg) bli behandlet farmakologisk i post-operasjonsperioden med systemiske injeksjoner av:

1. Analoge rekombinanter av GCSF (granocytt, 10 millioner IE/kg opp til maksimalt 30 millioner IE)
2. Analoge synteser av erytropoietin (Epoetin alfa eller beta 40 000 IE)

Begge faktorene vil bli administrert i passende konsentrasjoner for å stimulere mobilisering/rekruttering av hematopoietiske celler, i "regenerative" doser som ikke har vært assosiert med noen bivirkninger. Hver andre dag vil plasmanivået av erytropoietin og blodtellingen (inkludert hemoglobin og hvite blodlegemer) overvåkes. Hemoglobinnivåer større enn 15 g/dl vil gi anledning til bekymring for hyperviskositet og umiddelbar fjerning av 10-20 cc/kg blod og kan føre til tilsetning av en kontinuerlig infusjon av heparin for å holde APTT-nivåene (aktivert partiell tromboplastintid) mellom 40-60 sekunder. Nivåer av hvite blodlegemer over 50-60 000/μl vil bli ansett som "toksiske" og vil resultere i en reduksjon/suspensjon av GCSF-behandlingen inntil antallet faller under 30 000. Behandling med GCSF og erytropoietin vil bli utført annenhver dag i 2 uker etter transplantasjonen i henhold til følgende tabell:

Følge opp

Oppfølgingen vil bli utført ved hjerte-thoraxkirurgisk avdeling ved Krasnodar Regional Hospital, og vil omfatte:

1. Endoskopisk evaluering (fleksibel og/eller rigid bronkoskopi) av den transplanterte luftveien hver dag den første uken og annenhver dag i den andre uken, deretter en gang i måneden de første seks månedene, og hver 6. måned deretter de første 5 årene .
2. Evaluering av blodtellingen med formelen for hvite blodlegemer daglig de to første ukene.
3. Evaluering av mobiliserte progenitorceller fra perifert blod annenhver dag i løpet av 2 uker.
4. Immunogen evaluering. Etter 3, 7 og 30 dager fra transplantasjonen vil det bli tatt en blodprøve for å gjøre en studie av histokompatibiliteten ved å evaluere antistoffene. Den immunogene oppfølgingen vil også bli utført etter 3, 6 og 12 måneder fra transplantasjonen.
5. Postoperativ Tobramycin-inhalasjon (2x5ml/dag i 30 dager) for å forhindre lungebetennelse og transplantasjonsbakterieforurensning.
6. Datastyrt tomografi av nakke og bryst med en tredimensjonal rekonstruksjon av de transplanterte luftveiene vil bli gjort ved måned 1, måned 3 og måned 6 av oppfølgingen, og hver 6. måned deretter de første 5 årene.