喉頭気管組織工学による臨床移植

移植前に、患者は実験室および機器による評価を受けます。

移植の 3 日前に、患者は骨髄吸引を受けます。 骨髄単核細胞 (MNC) は、完全に密閉された FDA 承認の自動システム (Sepax、BioSafe America, Inc.) で赤血球 (RBC) から分離されます。 200 mL の容量で細胞培養培地 (DMEM + 10% アルブミンおよび 10% 自己血漿) で再懸濁された最終生成物は、600 mL トランスファーバッグに入れられます。 2 mL の製品を臨床使用前にバッグから取り出し、培地と免疫蛍光サイトメトリーを使用して無菌性をテストし、細胞の種類と生存率を特徴付けます。

移植の2日前に、患者は、顆粒球コロニー刺激因子（GCSF）（顆粒球、1 M IU/kg（最大. 15 M IU) およびエリスロポエチン、400 IU/kg (最大 6,000IU)。 これらは、手術の2日前に注射されます。

InBreath バイオリアクター (気管を培養するための特別なバイオリアクター) 現在のプロトコルでの作業には、Macchiarini P. ang 大学が以前に使用したバイオリアクターの設計が含まれます。 InBreath 3D Organ Bioreactor (Harvard Bioscience, Inc.) という名前で商品化されたこのデバイスは、組織培養インキュベーター内に配置するように設計されており、モジュラー ポリスルホン オルガン チャンバー、モーター ユニット、およびリモート コントローラーで構成されています。 チャンバーはモーターユニットから簡単に取り外すことができ、そのポリスルホン構造により、ピオリアの手術室ですぐに利用できる標準的なガスプラズマ滅菌プロセスで滅菌できます。 モーターユニットは、チャンバー内の組織ホルダーに一貫した回転を提供し、発達中の気管構造への流体力学的せん断力の制御された適用を保証します。 完全に密閉されたモーター ハウジングは、インキュベーター内の腐食性湿気からブラシレス モーターを保護します。 リモートコントロールユニットは、インキュベーターの外部に配置され、インキュベーター環境を乱すことなく回転速度を調整する手段を提供します。

播種した構築物をバイオリアクター内で96時間インキュベートした後、移植のために取り出した。 POSS-PCU (多面体オリゴマー シルセスキオキサン-ポリ(カーボネート-ウレア) ウレタン)、PET(ポリエチレン テレフタレート)、および PET:PU (ポリウレタン) 合成足場を使用した以前の 5 つの成人症例に基づいて、足場の内部および外部表面は新たに単離された骨髄単核細胞画分を播種する。 バイオリアクターを 0.5 サイクル/分の初期速度で 18 時間開始します (その後、2.5 サイクル/分まで段階的に増加させます)。 インキュベーションは、移植手順の 48 時間前に行われます。 このインキュベーション プロトコルは、3 つの異なる合成ナノコンポジット気管足場を使用して以前のケースで非常にうまく機能しました。

栽培手順:

気管の再播種手順は、確立され、完全に機能する当社の無菌培養 GMP (適正製造基準) 施設で行われます。

1. 分離された MNC は、骨髄分離のための Sepax 2 プロトコルに従って調製され、0.9% 生理食塩水 (10% ヒト アルブミンを含む) を含む 300ml バッグに再懸濁されます。
2. 滅菌された足場 (ガンマ線照射滅菌)、バイオリアクター (プラズマ滅菌)、手術器具 (オートクレーブ) は層流フードに配置されます。
3. 細胞/バイオリアクターと足場を操作しているすべての人は、GMP グレードの基準、つまり滅菌手袋、特定のオーバーオールなどについて十分に訓練されます。
4. バイオリアクターは、無菌状態でフード内に開かれ、無菌組織上に配置されます。 足場は器具を保持している臓器に取り付けられ、バイオリアクターに配置されます。 足場がバイオリアクターに移されて固定されると、MNC (+DMEM プラス アルブミンおよび自己血漿) が足場の表面に播種されます。 培地（自家血漿およびヒトアルブミンを含む）をバイオリアクターチャンバーに加えて総量200mlにする。
5. 因子が培地に追加されます: 39.3 ng/mL (100 nmol/L) デキサメタゾン、および 10 μg/mL インスリン。
6. 次に、バイオリアクターチャンバー（足場、MNC + 200 mlの培地を含む）をインキュベーターに入れ、バイオリアクターのモーターユニットに取り付けます（以前はインキュベーター内に配置されていました）。
7. バイオリアクターは、18 時間 0.5 サイクル/分の初期速度で開始されます (その後、2.5 サイクル/分まで段階的に増加します)。
8. 24時間後、前述の培地50mlを追加して、チャンバー内の総容量を250mlにします。 この時点で、チャンバー液の少量のアリコートをグラム染色でテストし、培地に注入して汚染をチェックします。
9. 48時間後にチャンバーを開け、培養とグラム染色のためにアリコートを採取します。 MTT生存率試験のために、新気管の小さな生検が行われます。 細胞が生存可能であり、培地汚染の兆候がないことが確認されたら (グラム染色および直接接種培養の中間読み取り)、気管は移植の準備ができていると見なされ、患者は麻酔下に置かれ、外科的処置が行われます。始めました。

移植日：

術中外科的処置 移植の朝、移植片を細胞増殖について試験する(MTT試験およびグラム染色による無菌性および中間培養結果の分析)。 移植片が移植の準備が整ったとみなされると、患者は全身気管内麻酔下に置かれます。

胸部および腹部の手順 気道の損傷した部分の切除を行った後、気道構築物は、内面の呼吸細胞生検で手術中に播種されます。 次に、移植片に、10 ng/mL の組換えヒト形質転換成長因子-β 3、10 nmol/L 組換え副甲状腺ホルモン関連ペプチド、100 nmol/L デキサメタゾン、および 10 μg/mL インスリンを含む成長因子を注入 (調整) します。 、GCSF (10 μ g/kg) およびエリスロポエチン (40,000 UI) (末梢造血細胞の動員を刺激するため)。 次いで、縫合糸を使用して気道欠損を再構築するために、インプラントを近位および遠位で吻合する。 次に、大網皮弁（胃の大きな屈曲部から剥がれ、右または左の胃大網動脈で採取され、横隔膜下または胸骨下で縦隔に運ばれる血管新生脂肪組織）で覆われ、包まれます。移植片と吻合部の長期的な保護を保証し、間接的な移植片の血管新生を獲得します。

移植後：

術後の治療

再生プロセスを促進するために、患者 (現在の体重約 13 Kg) は、手術後の期間に以下の全身注射による薬理学的治療を受けます。

1. GCSF の類似組換え体 (顆粒球、1000 万 IU/kg から最大 3000 万 IU)
2. エリスロポエチンの類似合成物 (エポエチン アルファまたはベータ 40,000 IU)

両方の因子は、造血細胞の動員/動員を刺激するのに適した濃度で、いかなる副作用も伴わない「再生」用量で投与される。 血漿エリスロポエチンレベルと血球数（ヘモグロビンと白血球数を含む）を隔日で監視します。 ヘモグロビンレベルが 15 g/dl を超えると、過粘稠度の懸念が生じ、10 ～ 20 cc/kg の血液が迅速に除去され、活性化部分トロンボプラスチン時間 (APTT) レベルを40～60秒。 50-60,000/μl を超える白血球レベルは「毒性」と見なされ、数値が 30,000 を下回るまで GCSF 療法の減量/中断が行われます。 GCSF とエリスロポエチンによる治療は、次の表に従って、移植後 2 週間、隔日で行われます。

ファローアップ

フォローアップは、クラスノダール地域病院の心臓胸部外科で実施され、以下が含まれます。

1. 移植された気道の内視鏡検査（軟性気管支鏡検査および/または硬性気管支鏡検査）は、最初の 1 週間は毎日、2 週間目は隔日、その後は最初の 6 か月は月に 1 回、その後は最初の 5 年間は 6 か月ごとに評価します。 .
2. 最初の 2 週間は毎日、白血球製剤による血球数の評価。
3. 2 週間、2 日おきに末梢血から動員された前駆細胞を評価します。
4. 免疫原性評価。 移植から 3 日、7 日、30 日後に血液サンプルを採取し、抗体を評価して組織適合性を調べます。 移植から3、6、12ヶ月後に免疫原性のフォローアップも実施されます。
5. 術後のトブラマイシン吸入 (2x5ml/日を 30 日間) により、肺炎と移植片の細菌汚染を防ぎます。
6. 移植された気道の三次元再構築を伴う首と胸部のコンピューター断層撮影は、フォローアップの1か月目、3か月目、6か月目に行われ、その後は最初の5年間は6か月ごとに行われます。