Laryngo-Tracheální tkáň-inženýrská klinická transplantace

Před transplantací budou pacienti absolvovat laboratorní a instrumentální vyšetření.

Tři dny před transplantací bude pacientovi provedena aspirace kostní dřeně. Mononukleární buňky kostní dřeně (MNC) budou izolovány z červených krvinek (RBC) ve zcela uzavřeném automatickém systému schváleném FDA (Sepax, BioSafe America, Inc.). Finální produkt, resuspendovaný v médiu pro kultivaci buněk (DMEM + 10 % albumin a 10 % autologní plazma) v objemu 200 ml, bude umístěn do 600 ml přenosného vaku. Před klinickým použitím se z vaku odeberou 2 ml produktu k testování sterility pomocí kultivačního média a imunofluorescenční cytometrie k charakterizaci buněčného typu a životaschopnosti.

Dva dny před transplantací pacient zahájí "posilující" terapii k mobilizaci buněk pomocí systémových injekcí analogických rekombinantů faktoru stimulujícího kolonie granulocytů (GCSF) (Granocyty, 1 M IU/kg (max. 15 M IU) a erytropoetin, 400 IU/kg (max. 6 000 IU). Ty budou aplikovány dva dny před operací.

Bioreaktor InBreath (speciální bioreaktor pro kultivaci průdušnice) Práce v rámci současného protokolu bude zahrnovat návrh bioreaktoru, který dříve využívaly vysoké školy Macchiarini P. ang pro úspěšnou první implantaci tkáňového inženýrství velké náhrady dýchacích cest. Zařízení komerčně dostupné pod názvem InBreath 3D Organ Bioreactor (Harvard Bioscience, Inc.) je navrženo pro umístění do inkubátoru pro tkáňové kultury a skládá se z modulární polysulfonové orgánové komory, motorické jednotky a dálkového ovladače. Komora je snadno oddělitelná od motorové jednotky a její polysulfonová konstrukce umožňuje sterilizaci standardním procesem sterilizace plynovou plazmou, který je snadno dostupný na operačním sále v Peorii. Motorová jednotka zajišťuje konzistentní rotaci držáku tkáně v komoře a zajišťuje řízenou aplikaci hydrodynamických smykových sil na vyvíjející se tracheální konstrukci. Plně uzavřený kryt motoru chrání bezkomutátorový motor před korozivní vlhkostí v inkubátoru. Jednotka dálkového ovládání je umístěna vně inkubátoru a poskytuje prostředek pro nastavení rychlosti otáčení bez narušení prostředí inkubátoru.

Naočkovaný konstrukt se nechal inkubovat v bioreaktoru po dobu 96 hodin před vyjmutím pro implantaci. Na základě pěti předchozích případů pro dospělé s použitím syntetických lešení POSS-PCU (polyhedrální oligomerní silsesquioxan-poly(karbonát-močovina) uretan), PET (polyethylentereftalát) a PET:PU (polyuretan), budou vnitřní a vnější povrchy lešení být naočkován čerstvě izolovanou frakcí mononukleárních buněk kostní dřeně. Bioreaktor bude spuštěn s počáteční rychlostí 0,5 cyklů/min po dobu 18 hodin (poté postupně zvyšovat až na 2,5 cyklů/min). Inkubace bude probíhat 48 hodin před transplantačním postupem. Tento inkubační protokol fungoval velmi dobře v předchozích případech s použitím tří různých syntetických nanokompozitních tracheálních lešení.

Kroky kultivace:

Postup opětovného výsevu trachey bude proveden v našem zařízení pro aseptickou kulturu GMP (Good Manufacturing Practice), které bylo zřízeno a plně funkční.

1. Izolované MNC budou připraveny podle protokolu Sepax 2 pro separaci kostní dřeně a resuspendovány ve 300ml vaku obsahujícím 0,9% normální fyziologický roztok (s 10% lidským albuminem).
2. Sterilizované lešení (sterilizace gama zářením), bioreaktor (plazmová sterilizace) a chirurgické nástroje (autoklávované) budou umístěny do laminárního krytu.
3. Všechny osoby, které manipulují s buňkami/bioreaktorem a lešením, budou plně proškoleny, aby měly standardy GMP, konkrétně sterilní rukavice, specifické kombinézy atd.
4. Bioreaktor bude otevřen uvnitř krytu ve sterilních podmínkách a umístěn na sterilní tkáň. Lešení bude namontováno na držáky orgánů a umístěno do bioreaktoru. Jakmile je skafold přenesen a fixován do bioreaktoru, MNC (+DMEM plus albumin a autologní plazma) bude naočkován na povrch lešení. Do komory bioreaktoru bude přidáno médium (včetně autologní plazmy a lidského albuminu) do celkového objemu 200 ml.
5. K médiu se přidají faktory: 39,3 ng/ml (100 nmol/L) dexamethasonu a 10 μg/ml inzulínu.
6. Poté bude komora bioreaktoru (včetně lešení, MNC + 200 ml média) umístěna do inkubátoru a namontována na motorovou jednotku bioreaktoru (dříve umístěnou uvnitř inkubátoru).
7. Bioreaktor bude spuštěn s počáteční rychlostí 0,5 cyklu/min po dobu 18 hodin (poté postupně zvyšovat až na 2,5 cyklu/min).
8. Po 24 hodinách se přidá dalších 50 ml předem uvedeného média do celkového objemu 250 ml uvnitř komory. V tomto okamžiku bude malý alikvot komůrkové tekutiny testován gramovým barvivem a injikován do kultivačního média pro kontrolu kontaminace.
9. Po 48 hodinách se komora otevře a odebere se alikvot pro kultivaci a Gramovo barvení. Pro test životaschopnosti MTT bude odebrána malá biopsie neotrachey. Jakmile se určí, že buňky jsou životaschopné a nevykazují žádné známky kontaminace média (barvení podle Grama a prozatímní odečet přímé inokulační kultury), bude trachea považována za připravenou k implantaci a pacient bude uveden do anestezie a bude zahájen chirurgický zákrok. začala.

Den transplantace:

Peroperační chirurgický postup Ráno v den transplantace bude štěp testován na buněčný růst (MTT test a na sterilitu gramovým barvením a analýzou výsledků interim kultivace). Jakmile je štěp považován za připravený k implantaci, bude pacient uveden do celkové endotracheální anestezie.

Hrudní a břišní výkony Po provedení resekce poškozeného segmentu dýchacích cest bude konstrukce dýchacích cest naočkována intraoperačně s biopsií respiračních buněk na vnitřním povrchu. Štěp bude poté injikován (kondicionován) růstovými faktory včetně 10 ng/ml rekombinantního lidského transformujícího růstového faktoru-β 3, 10 nmol/l rekombinantního peptidu příbuzného parathormonu, 100 nmol/l dexamethasonu a 10 ug/ml inzulínu GCSF (10 ug/kg) a Erytropoetin (40 000 UI) (pro stimulaci mobilizace periferních hematopoetických buněk). Implantát bude poté anastomózován proximálně a distálně, aby se pomocí stehů rekonstruoval defekt dýchacích cest. Poté se zakryje a obalí lalokem omentum major (tuková vaskularizovaná tkáň oddělená od velkého ohybu žaludku, odebraná z pravé nebo levé gastroepiploické tepny a poté přenesena do mediastina trans-diafragmaticky nebo substernálně), aby zaručit dlouhodobou ochranu štěpu a anastomózy a dosáhnout nepřímé neovaskularizace štěpu.

Po transplantaci:

Pooperační léčba

Pro posílení regeneračního procesu bude pacient (aktuální hmotnost asi 13 kg) v pooperačním období léčen farmakologicky systémovými injekcemi:

1. Analogické rekombinanty GCSF (Granocyty, 10 milionů IU/kg až do maxima 30 milionů IU)
2. Analogické syntetické látky erytropoetinu (epoetin alfa nebo beta 40 000 IU)

Oba faktory budou podávány ve vhodných koncentracích pro stimulaci mobilizace/náboru hematopoetických buněk v "regeneračních" dávkách, které nebyly spojeny s žádnými vedlejšími účinky. Každý druhý den bude sledována hladina erytropoetinu v plazmě a krevní obraz (včetně hemoglobinu a počtu bílých krvinek). Hladiny hemoglobinu vyšší než 15 g/dl budou vyvolávat obavy z hyperviskozity a rychlého odstranění 10-20 cc/kg krve a mohou vyvolat přidání kontinuální infuze heparinu k udržení hladin aktivovaného parciálního tromboplastinového času (APTT) mezi 40-60 sekund. Hladiny bílých krvinek nad 50-60 000/μl budou považovány za „toxické“ a budou mít za následek snížení/pozastavení terapie GCSF, dokud počet neklesne pod 30 000. Léčba GCSF a erytropoetinem se bude provádět každý druhý den po dobu 2 týdnů po transplantaci podle následující tabulky:

Následovat

Sledování bude probíhat na oddělení kardiotorakální chirurgie Krasnodarské krajské nemocnice a bude zahrnovat:

1. Endoskopické hodnocení (flexibilní a/nebo rigidní bronchoskopie) transplantovaných dýchacích cest každý den po dobu prvního týdne a každý druhý den po dobu druhého týdne, poté jednou měsíčně po dobu prvních šesti měsíců a poté každých 6 měsíců po dobu prvních 5 let .
2. Vyhodnocování krevního obrazu pomocí vzorce bílých krvinek denně po dobu prvních dvou týdnů.
3. Hodnocení mobilizovaných progenitorových buněk z periferní krve každý druhý den po dobu 2 týdnů.
4. Imunogenní hodnocení. Po 3, 7 a 30 dnech od transplantace bude odebrán vzorek krve pro provedení studie histokompatibility vyhodnocením protilátek. Imunogenní sledování bude také provedeno po 3, 6 a 12 měsících od transplantace.
5. Pooperační inhalace tobramycinu (2x5 ml/den po dobu 30 dnů) k prevenci pneumonie a bakteriální kontaminace štěpu.
6. Počítačová tomografie krku a hrudníku s trojrozměrnou rekonstrukcí transplantovaných dýchacích cest bude provedena v 1. měsíci, 3. měsíci a 6. měsíci sledování a poté každých 6 měsíců po dobu prvních 5 let.