Gége-légcsőszövet-mérnöki klinikai transzplantáció

A transzplantáció előtt a betegek laboratóriumi és műszeres kiértékelést végeznek.

Három nappal a transzplantáció előtt a páciens csontvelő-aspiráción esik át. A csontvelő mononukleáris sejtjeit (MNC) izolálják a vörösvértestekből (RBC) egy teljesen zárt, FDA által jóváhagyott automata rendszerben (Sepax, BioSafe America, Inc.). A sejttenyésztő tápközeggel (DMEM+10% albumin és 10% autológ plazma) 200 ml térfogatban újraszuszpendált végterméket egy 600 ml-es transzfer zsákba helyezzük. Klinikai felhasználás előtt 2 ml terméket vesznek ki a zsákból, hogy a sterilitást tápközeggel és immunfluoreszcens citometriával teszteljék a sejttípus és életképesség jellemzésére.

Két nappal a transzplantáció előtt a páciens "fokozó" terápiát kezd a sejtek mobilizálása érdekében a granulocita telep-stimuláló faktor (GCSF) analóg rekombinánsainak szisztémás injekcióival (Granocyte, 1 M NE/kg (max. 15 M NE) és eritropoetin, 400 NE/kg (max. 6000 NE). Ezeket a műtétet megelőző két napon keresztül injekciózzák.

InBreath Bioreactor (a légcső kultiválására szolgáló speciális bioreaktor) A jelenlegi protokollban szereplő munka egy olyan bioreaktor tervezést foglal magában, amelyet korábban a Macchiarini P. ang kollégiumok használtak egy szövetmérnöki nagy légúti pótlás sikeres, első emberben történő beültetésénél. Az InBreath 3D Organ Bioreactor (Harvard Bioscience, Inc.) néven forgalmazott eszközt szövettenyésztő inkubátorban való elhelyezésre tervezték, és egy moduláris poliszulfon szervkamrából, motoros egységből és távirányítóból áll. A kamra könnyen leválasztható a motoregységről, poliszulfon konstrukciója pedig lehetővé teszi a sterilizálást a peoriai műtőben elérhető szabványos gázplazma sterilizációs eljárással. A motoros egység egyenletes forgást biztosít a szövettartó számára a kamrán belül, biztosítva a hidrodinamikus nyíróerők szabályozott alkalmazását a fejlődő légcsőkonstrukcióra. A teljesen zárt motorház megvédi a kefe nélküli motort az inkubátorban lévő korrozív nedvességtől. A távirányító egység az inkubátoron kívül van elhelyezve, és lehetővé teszi a forgási sebesség beállítását az inkubátor környezetének megzavarása nélkül.

A beoltott konstrukciót 96 órán át hagytuk inkubálni a bioreaktorban, mielőtt az implantációhoz eltávolítottuk. A POSS-PCU (poliéderes oligomer szilszeszkvioxán-poli(karbonát-karbamid) uretán), PET (polietilén-tereftalát) és PET:PU (poliuretán) szintetikus állványzattal végzett öt korábbi felnőtt eset alapján az scaffold belső és külső felülete lesz. beoltják a frissen izolált csontvelői mononukleáris sejtfrakcióval. A bioreaktort 0,5 ciklus/perc kezdeti sebességgel indítjuk 18 órán keresztül (majd fokozatosan növeljük 2,5 ciklus/percig). Az inkubáció a transzplantációs eljárást megelőző 48 órában történik. Ez az inkubációs protokoll nagyon jól működött a korábbi esetekben a három különböző szintetikus nanokompozit légcsőállvány használatával.

A termesztés lépései:

A légcső újraoltási eljárását az aszeptikus tenyésztő GMP (Good Manufacturing Practice) létesítményünkben fogjuk elvégezni, amely már kialakított és teljesen működőképes.

1. Az izolált MNC-t a Sepax 2 protokoll szerint készítik elő a csontvelő-leválasztáshoz, és újraszuszpendálják egy 0,9% normál sóoldatot (10% humán albumint tartalmazó) tartalmazó 300 ml-es tasakban.
2. A lamináris burkolatba kerül a sterilizált állvány (gamma-besugárzásos sterilizálás), a bioreaktor (plazmasterilizálás) és a sebészeti műszerek (autoklávozva).
3. Minden személy, aki manipulálja a sejteket/bioreaktort és az állványzatot, teljes képzésben részesül a GMP-minőségű szabványok betartására, nevezetesen steril kesztyűk, speciális overallok stb.
4. A bioreaktort steril körülmények között kinyitják a burkolaton belül, és steril szövetre helyezik. Az állványt az orgonatartó szerelvényekre kell felszerelni és a bioreaktorba helyezni. Miután az állványt áthelyezték és rögzítik a bioreaktorba, az MNC (+DMEM plusz albumin és autológ plazma) az állvány felületére kerül. A táptalajt (beleértve az autológ plazmát és a humán albumint is) a bioreaktor kamrájába adják 200 ml össztérfogatig.
5. A faktorok hozzáadódnak a táptalajhoz: 39,3 ng/ml (100 nmol/L) dexametazon és 10 μg/ml inzulin.
6. Ezután a bioreaktor kamráját (az állványzattal együtt, MNC + 200 ml táptalaj) az inkubátorba helyezzük, és a bioreaktor motoros egységére szereljük (előzőleg az inkubátor belsejében volt elhelyezve).
7. A bioreaktort 0,5 ciklus/perc kezdeti sebességgel indítjuk 18 órán keresztül (majd fokozatosan növeljük 2,5 ciklus/percig).
8. 24 óra elteltével további 50 ml fent említett táptalajt adunk a kamrába 250 ml teljes térfogathoz. Ekkor a kamrafolyadék egy kis aliquot részét grammos festéssel tesztelik, és a tenyésztőközegbe fecskendezik a szennyeződés ellenőrzésére.
9. 48 óra elteltével a kamrát kinyitják, és egy alikvot részt begyűjtenek a tenyésztéshez és a Gram-festéshez. Egy kis biopsziát vesznek a neotracheából az MTT életképességi teszthez. Ha megállapítást nyert, hogy a sejtek életképesek, és nincs nyoma a táptalaj szennyeződésének (Gram-festés és a közvetlen oltás tenyészetének időközi leolvasása), a légcső készen áll a beültetésre, és a beteget altatás alá helyezik, és a sebészeti beavatkozást elvégzik. elindult.

Az átültetés napja:

Intraoperatív sebészeti eljárás A transzplantáció reggelén a graftot sejtnövekedés szempontjából teszteljük (MTT-teszt és a sterilitás grammos festéssel és a közbenső tenyésztési eredmények elemzése). Ha a graft beültetésre készen áll, a beteget általános endotracheális érzéstelenítés alá helyezik.

Mellkasi és hasi eljárások A légút sérült szegmensének reszekcióját követően a légúti konstrukciót intraoperatívan beoltjuk a légúti sejtbiopsziákkal a belső felületre. A graftot ezután növekedési faktorokkal injektálják (kondicionálják), beleértve 10 ng/ml rekombináns humán transzformáló növekedési faktor-β3-at, 10 nmol/L rekombináns parathormonhoz kapcsolódó peptidet, 100 nmol/L dexametazont és 10 µg/ml inzulint. , GCSF (10 µg/kg) és eritropoetin (40 000 UI) (a perifériás hematopoietikus sejtek mobilizálásának serkentésére). Ezután az implantátumot proximálisan és disztálisan anasztomizálják, hogy a légúti defektust varratokkal rekonstruálják. Ezt követően egy omentum major lebeny fedi és burkolja be (zsíros vaszkularizált szövet, amely leválik a gyomor nagy hajlatából, a jobb vagy a bal gastroepiploicus artériából gyűjtik össze, majd transz-diafragmatikusan vagy szubszternálisan a mediastinumba kerül), garantálják a graft és az anasztomózis hosszú távú védelmét, és elérik a graft indirekt neovaszkularizációját.

Transzplantáció után:

Műtét utáni kezelés

A regenerációs folyamat felgyorsítása érdekében a pácienst (jelenlegi súlya kb. 13 kg) a műtét utáni időszakban gyógyszeres kezelésben részesítjük szisztémás injekciókkal:

1. GCSF analóg rekombinánsai (Granocyte, 10 millió NE/kg, maximum 30 millió NE)
2. Az eritropoetin analóg szintetikája (epoetin alfa vagy béta 40 000 NE)

Mindkét faktort megfelelő koncentrációban adjuk be a vérképző sejtek mobilizálásának/rekrutációjának stimulálására, olyan "regeneratív" dózisokban, amelyek nem járnak semmilyen mellékhatással. Minden második napon ellenőrizni fogják a plazma eritropoetin szintjét és a vérképet (beleértve a hemoglobint és a fehérvérsejtszámot is). A 15 g/dl-nél nagyobb hemoglobinszint aggodalomra ad okot a túlzott viszkozitás és a 10-20 cc/kg vér azonnali eltávolítása miatt, és folyamatos heparin infúzió hozzáadását teheti szükségessé, hogy az aktivált részleges tromboplasztin idő (APTT) szintje között maradjon. 40-60 másodperc. Az 50-60 000/μl feletti fehérvérsejt-szint "toxikusnak" minősül, és a GCSF-terápia csökkentését/felfüggesztését eredményezi, amíg a számok 30 000 alá nem csökkennek. A GCSF-fel és az eritropoetinnel történő kezelést minden második napon végezzük a transzplantációt követő 2 héten keresztül, az alábbi táblázat szerint:

Nyomon követés

A nyomon követést a Krasznodari Regionális Kórház Szív- és mellkassebészeti osztályán végzik, és a következőket foglalják magukban:

1. Az átültetett légutak endoszkópos értékelése (flexibilis és/vagy merev bronchoszkópia) az első héten minden nap, a második héten minden második napon, ezt követően az első hat hónapban havonta egyszer, ezt követően pedig az első 5 évben 6 havonta .
2. A vérkép értékelése fehérvérsejt-képlettel az első két hétben naponta.
3. Mobilizált progenitor sejtek értékelése perifériás vérből 2 héten keresztül minden második napon.
4. Immunogén értékelés. A transzplantációt követő 3, 7 és 30 nap elteltével vérmintát vesznek, hogy megvizsgálják a hisztokompatibilitást az antitestek értékelésével. Az immunogén nyomon követésre a transzplantációt követő 3, 6 és 12 hónap elteltével is sor kerül.
5. Műtét utáni tobramicin inhaláció (2x5 ml/nap 30 napig) a tüdőgyulladás és a graft bakteriális fertőzésének megelőzésére.
6. A nyak és a mellkas számítógépes tomográfiája az átültetett légutak háromdimenziós rekonstrukciójával az utánkövetés 1., 3. és 6. hónapjában, majd ezt követően 6 havonta történik az első 5 évben.