Laryngo-Tracheal Tissue-Engineered Clinical Transplantation

Vor der Transplantation werden bei den Patienten Labor- und Instrumentenuntersuchungen durchgeführt.

Drei Tage vor der Transplantation wird dem Patienten eine Knochenmarkpunktion unterzogen. Die mononukleären Knochenmarkszellen (MNC) werden aus den roten Blutkörperchen (RBC) in dem vollständig geschlossenen, von der FDA zugelassenen automatischen System (Sepax, BioSafe America, Inc.) isoliert. Das Endprodukt, resuspendiert mit Zellkulturmedium (DMEM + 10 % Albumin und 10 % autologes Plasma) in einem Volumen von 200 ml, wird in einen 600-ml-Transferbeutel gegeben. 2 ml des Produkts werden vor der klinischen Verwendung aus dem Beutel entnommen, um die Sterilität mit Kulturmedien und Immunfluoreszenzzytometrie zu testen, um den Zelltyp und die Lebensfähigkeit zu charakterisieren.

Zwei Tage vor der Transplantation beginnt der Patient mit einer „Boosting“-Therapie zur Mobilisierung von Zellen durch systemische Injektionen analoger Rekombinanten des Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktors (GCSF) (Granocyte, 1 M IE/kg (max. 15 M IE) und Erythropoietin, 400 IE/kg (max. 6.000 IE). Diese werden zwei Tage vor der Operation injiziert.

InBreath Bioreactor (der spezielle Bioreaktor für die Kultivierung der Luftröhre) Die Arbeit im aktuellen Protokoll wird ein Bioreaktordesign umfassen, das zuvor von den Macchiarini P. ang Colleges bei einer erfolgreichen Erstimplantation eines durch Gewebezüchtung hergestellten großen Atemwegsersatz beim Menschen verwendet wurde. Das Gerät, das unter dem Namen InBreath 3D Organ Bioreactor (Harvard Bioscience, Inc.) vertrieben wird, ist für die Platzierung in einem Gewebekulturinkubator ausgelegt und besteht aus einer modularen Polysulfon-Organkammer, einer Motoreinheit und einer Fernbedienung. Die Kammer lässt sich leicht von der Motoreinheit abnehmen, und ihre Polysulfonkonstruktion ermöglicht die Sterilisation mit dem Standard-Gas-Plasma-Sterilisationsverfahren, das im Operationssaal in Peoria leicht verfügbar ist. Die Motoreinheit sorgt für eine gleichmäßige Drehung des Gewebehalters innerhalb der Kammer und gewährleistet so die kontrollierte Anwendung hydrodynamischer Scherkräfte auf das sich entwickelnde Trachealkonstrukt. Ein vollständig geschlossenes Motorgehäuse schützt den bürstenlosen Motor vor der korrosiven Feuchtigkeit im Inkubator. Die Fernsteuereinheit wird außerhalb des Inkubators platziert und bietet ein Mittel zum Einstellen der Rotationsgeschwindigkeit, ohne die Umgebung des Inkubators zu stören.

Das beimpfte Konstrukt wurde 96 Stunden lang im Bioreaktor inkubiert, bevor es zur Implantation entfernt wurde. Basierend auf den fünf vorherigen Fällen von Erwachsenen, bei denen die synthetischen Gerüste POSS-PCU (polyedrisches oligomeres Silsesquioxan-Poly(carbonat-Harnstoff)-Urethan), PET (Polyethylenterephthalat) und PET:PU (Polyurethan) verwendet wurden, werden die inneren und äußeren Oberflächen des Gerüsts mit der frisch isolierten mononukleären Knochenmarkzellfraktion ausgesät werden. Der Bioreaktor wird mit einer Anfangsgeschwindigkeit von 0,5 Zyklen/min für 18 Stunden gestartet (dann schrittweise auf 2,5 Zyklen/min erhöhen). Die Inkubation erfolgt während der 48 Stunden vor dem Transplantationsverfahren. Dieses Inkubationsprotokoll hat in den vorherigen Fällen mit den drei verschiedenen synthetischen Trachealgerüsten aus Nanokomposit sehr gut funktioniert.

Anbauschritte:

Das Tracheal-Reseeding-Verfahren wird in unserer GMP-Anlage (Good Manufacturing Practice) für aseptische Kulturen durchgeführt, die eingerichtet und voll funktionsfähig ist.

1. Isolierte MNC werden gemäß dem Sepax 2-Protokoll für die Knochenmarkstrennung präpariert und in einem 300-ml-Beutel mit 0,9 % normaler Kochsalzlösung (mit 10 % Humanalbumin) resuspendiert.
2. Das sterilisierte Scaffold (Gammabestrahlungssterilisation), der Bioreaktor (Plasmasterilisation) und die chirurgischen Instrumente (autoklaviert) werden in die Laminarhaube gelegt.
3. Alle Personen, die die Zellen/den Bioreaktor und das Gerüst manipulieren, werden vollständig darin geschult, GMP-Standards zu haben, nämlich sterile Handschuhe, spezielle Overalls usw.
4. Der Bioreaktor wird unter sterilen Bedingungen in der Haube geöffnet und auf ein steriles Tuch gelegt. Das Gerüst wird an den Organhalterungen montiert und in den Bioreaktor gestellt. Sobald das Gerüst in den Bioreaktor transferiert und fixiert ist, wird das MNC (+DMEM plus Albumin und autologes Plasma) auf die Oberfläche des Gerüsts ausgesät. Medium (einschließlich autologem Plasma und Humanalbumin) wird in die Bioreaktorkammer bis zu einem Gesamtvolumen von 200 ml gegeben.
5. Die Faktoren werden dem Medium hinzugefügt: 39,3 ng/ml (100 nmol/l) Dexamethason und 10 μg/ml Insulin.
6. Dann wird die Bioreaktorkammer (einschließlich Gerüst, MNC + 200 ml Medium) in den Inkubator gestellt und auf die Motoreinheit des Bioreaktors montiert (zuvor im Inkubator platziert).
7. Der Bioreaktor wird mit einer Anfangsgeschwindigkeit von 0,5 Zyklen/min für 18 h gestartet (dann schrittweise auf 2,5 Zyklen/min erhöhen).
8. Nach 24 Stunden werden weitere 50 ml des vorgenannten Mediums zu einem Gesamtvolumen von 250 ml in der Kammer hinzugefügt. Zu diesem Zeitpunkt wird ein kleines Aliquot der Kammerflüssigkeit mit Gram-Färbung getestet und in das Kulturmedium injiziert, um es auf Kontamination zu prüfen.
9. Nach 48 Stunden wird die Kammer geöffnet und ein Aliquot wird für Kultur und Gram-Färbung geerntet. Für den MTT-Viabilitätstest wird eine kleine Biopsie der Neotrachea entnommen. Sobald festgestellt wurde, dass die Zellen lebensfähig sind und es keine Anzeichen einer Medienkontamination gibt (Gram-Färbung und Zwischenablesung der direkten Inokulationskultur), gilt die Luftröhre als bereit für die Implantation und der Patient wird unter Anästhesie gesetzt und der chirurgische Eingriff durchgeführt gestartet.

Tag der Transplantation:

Intraoperatives chirurgisches Verfahren Am Morgen der Transplantation wird das Transplantat auf Zellwachstum (MTT-Test und auf Sterilität durch Gram-Färbung und Analyse der Zwischenkulturergebnisse) getestet. Sobald das Transplantat für die Implantation bereit ist, wird der Patient unter allgemeiner endotrachealer Anästhesie platziert.

Thorax- und abdominale Eingriffe Nach der Resektion des geschädigten Atemwegssegments wird das Atemwegskonstrukt intraoperativ mit den Atemwegszellbiopsien auf der Innenfläche ausgesät. Dem Transplantat werden dann Wachstumsfaktoren injiziert (konditioniert), einschließlich 10 ng/ml rekombinanter humaner transformierender Wachstumsfaktor-β 3, 10 nmol/l rekombinantes Parathormon-verwandtes Peptid, 100 nmol/l Dexamethason und 10 ug/ml Insulin , GCSF (10 ug/kg) und Erythropoietin (40.000 UI) (um die Mobilisierung der peripheren hämatopoetischen Zellen zu stimulieren). Das Implantat wird dann proximal und distal anastomosiert, um den Atemwegsdefekt mit Nähten zu rekonstruieren. Es wird dann von einem Omentum major-Lappen (vaskularisiertes Fettgewebe, das von der großen Magenkrümmung abgelöst, an der rechten oder linken gastroepiploischen Arterie entnommen und dann transdiaphragmatisch oder substernal zum Mediastinum übertragen wird) bedeckt und umwickelt garantieren einen langfristigen Schutz des Transplantats und der Anastomose und erhalten eine indirekte Neovaskularisation des Transplantats.

Nach Transplantation:

Postoperative Behandlung

Um den Regenerationsprozess anzukurbeln, wird der Patient (derzeitiges Gewicht ca. 13 kg) in der postoperativen Phase pharmakologisch behandelt durch systemische Injektionen von:

1. Analoge Rekombinanten von GCSF (Granocyte, 10 Millionen IE/kg bis maximal 30 Millionen IE)
2. Analoge synthetische Produkte von Erythropoietin (Epoetin alpha oder beta 40.000 IE)

Beide Faktoren werden in geeigneten Konzentrationen verabreicht, um die Mobilisierung/Rekrutierung hämatopoetischer Zellen zu stimulieren, in "regenerativen" Dosen, die nicht mit irgendwelchen Nebenwirkungen in Verbindung gebracht wurden. Jeden zweiten Tag werden der Erythropoetin-Plasmaspiegel und das Blutbild (einschließlich Hämoglobin und Leukozytenzahl) überwacht. Hämoglobinwerte von mehr als 15 g/dl geben Anlass zu Bedenken hinsichtlich Hyperviskosität und sofortiger Entfernung von 10-20 cc/kg Blut und können die Zugabe einer kontinuierlichen Heparininfusion veranlassen, um die Werte der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (APTT) dazwischen zu halten 40-60 Sekunden. Leukozytenwerte über 50-60.000/μl gelten als „toxisch“ und führen zu einer Reduzierung/Aussetzung der GCSF-Therapie, bis die Anzahl unter 30.000 fällt. Die Behandlung mit GCSF und Erythropoietin wird jeden zweiten Tag für 2 Wochen nach der Transplantation gemäß der folgenden Tabelle durchgeführt:

Nachverfolgen

Die Nachsorge wird in der Abteilung für Herz-Thorax-Chirurgie des Regionalkrankenhauses Krasnodar durchgeführt und umfasst:

1. Endoskopische Untersuchung (flexible und/oder starre Bronchoskopie) des transplantierten Atemwegs täglich in der ersten Woche und jeden zweiten Tag in der zweiten Woche, danach einmal monatlich in den ersten sechs Monaten und danach alle 6 Monate in den ersten 5 Jahren .
2. Auswertung des Blutbildes mit weißer Blutkörperchenformel täglich in den ersten zwei Wochen.
3. Auswertung mobilisierter Vorläuferzellen aus peripherem Blut jeden zweiten Tag während 2 Wochen.
4. Immunogene Bewertung. 3, 7 und 30 Tage nach der Transplantation wird eine Blutprobe entnommen, um die Histokompatibilität durch Bewertung der Antikörper zu untersuchen. Die immunogene Nachsorge wird auch 3, 6 und 12 Monate nach der Transplantation durchgeführt.
5. Postoperative Tobramycin-Inhalation (2 x 5 ml/Tag für 30 Tage), um einer Lungenentzündung und einer bakteriellen Kontamination des Transplantats vorzubeugen.
6. Eine Computertomographie des Halses und der Brust mit einer dreidimensionalen Rekonstruktion der transplantierten Atemwege wird in Monat 1, Monat 3 und Monat 6 der Nachsorge und danach alle 6 Monate in den ersten 5 Jahren durchgeführt.