Клиническая трансплантация ларинго-трахеальных тканей с инженерией тканей

Перед трансплантацией пациентам будут проведены лабораторные и инструментальные исследования.

За три дня до трансплантации пациенту будет проведена аспирация костного мозга. Мононуклеарные клетки костного мозга (MNC) будут изолированы от эритроцитов (RBC) в полностью закрытой автоматической системе, одобренной FDA (Sepax, BioSafe America, Inc.). Конечный продукт, ресуспендированный в среде для культивирования клеток (DMEM + 10% альбумин и 10% аутологичной плазмы) в объеме 200 мл, будет помещен в мешок для переноса объемом 600 мл. 2 мл продукта берут из пакета перед клиническим применением для проверки стерильности с использованием питательных сред и иммунофлуоресцентной цитометрии для характеристики типа клеток и их жизнеспособности.

За два дня до трансплантации пациенту будет начата «стимулирующая» терапия для мобилизации клеток посредством системных инъекций аналогов рекомбинантов гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ) (Граноцит, 1 М МЕ/кг (макс. 15 м МЕ) и эритропоэтин, 400 МЕ/кг (макс. 6000 МЕ). Их вводят за два дня до операции.

InBreath Bioreactor (специальный биореактор для культивирования трахеи) Работа по текущему протоколу будет включать в себя конструкцию биореактора, ранее использовавшуюся колледжами Macchiarini P. ang для успешной первой имплантации человеку тканеинженерной замены больших дыхательных путей. Устройство, выпускаемое под названием InBreath 3D Organ Bioreactor (Harvard Bioscience, Inc.), предназначено для размещения в инкубаторе для тканевых культур и состоит из модульной камеры для органов из полисульфона, моторного блока и пульта дистанционного управления. Камера легко отделяется от блока двигателя, а ее полисульфоновая конструкция позволяет проводить стерилизацию с помощью стандартного процесса стерилизации газовой плазмой, который легко доступен в операционной в Пеории. Блок двигателя обеспечивает постоянное вращение держателя ткани внутри камеры, гарантируя контролируемое приложение гидродинамических сил сдвига к развивающейся конструкции трахеи. Полностью закрытый корпус двигателя защищает бесщеточный двигатель от агрессивной влаги внутри инкубатора. Блок дистанционного управления размещается снаружи инкубатора, что позволяет регулировать скорость вращения, не нарушая окружающей среды инкубатора.

Засеянной конструкции давали возможность инкубироваться в биореакторе в течение 96 часов перед удалением для имплантации. Основываясь на пяти предыдущих случаях использования синтетических каркасов POSS-PCU (полиэдрический олигомерный силсесквиоксан-поли(карбонат-мочевина)уретан), ПЭТ (полиэтилентерефталат) и ПЭТ:ПУ (полиуретан), внутренние и внешние поверхности каркаса будут засевают свежевыделенной фракцией мононуклеарных клеток костного мозга. Биореактор запустят с начальной скоростью 0,5 циклов/мин на 18 часов (затем ступенчато увеличьте до 2,5 циклов/мин). Инкубация будет в течение 48 часов, предшествующих процедуре трансплантации. Этот протокол инкубации работал очень хорошо в предыдущих случаях с использованием трех различных синтетических нанокомпозитных каркасов трахеи.

Этапы выращивания:

Процедура повторного посева трахеи будет проводиться в нашем оборудованном и полностью функционирующем помещении для асептических культур GMP (надлежащая производственная практика).

1. Изолированные MNC будут подготовлены в соответствии с протоколом Sepax 2 для отделения костного мозга и ресуспендированы в пакете объемом 300 мл, содержащем 0,9% нормальный физиологический раствор (с 10% человеческим альбумином).
2. Стерилизованный каркас (стерилизация гамма-облучением), биореактор (стерилизация плазмой) и хирургические инструменты (автоклавированные) будут помещены в ламинарный бокс.
3. Все лица, которые манипулируют ячейками/биореактором и каркасом, будут полностью обучены стандартам GMP, а именно стерильным перчаткам, специальной спецодежде и т. д.
4. Биореактор будет открыт внутри колпака в стерильных условиях и помещен на стерильную ткань. Каркас будет установлен на креплениях для органов и помещен в биореактор. Как только каркас будет перенесен и зафиксирован в биореакторе, MNC (+DMEM плюс альбумин и аутологичная плазма) будут засеяны на поверхность каркаса. Среду (включая аутологичную плазму и человеческий альбумин) добавляют в камеру биореактора до общего объема 200 мл.
5. В среду добавляются факторы: 39,3 нг/мл (100 нмоль/л) дексаметазона и 10 мкг/мл инсулина.
6. Затем камеру биореактора (включая каркас, МНК + 200 мл среды) помещают в инкубатор и монтируют на моторный блок биореактора (предварительно помещенный внутрь инкубатора).
7. Биореактор будет запускаться с начальной скоростью 0,5 циклов/мин на 18 часов (затем постепенно увеличивать до 2,5 циклов/мин).
8. Через 24 часа добавляются дополнительные 50 мл вышеупомянутой среды к общему объему 250 мл внутри камеры. В это время небольшую аликвоту камерной жидкости проверяют с помощью окрашивания по Граму и вводят в питательную среду для проверки на наличие контаминации.
9. Через 48 часов камеру открывают и берут аликвоту для посева и окрашивания по Граму. Для теста на жизнеспособность МТТ будет взята небольшая биопсия неотрахеи. Как только будет определено, что клетки жизнеспособны и нет признаков загрязнения среды (окрашивание по Граму и промежуточное считывание культуры прямого посева), трахея будет считаться готовой к имплантации, пациент будет помещен под анестезию, а хирургическая процедура будет завершена. начал.

День трансплантации:

Интраоперационная хирургическая процедура. Утром в день трансплантации трансплантат проверяют на рост клеток (МТТ-тест и на стерильность с помощью окрашивания по Граму и анализ промежуточных результатов посева). После того, как трансплантат будет готов к имплантации, пациент будет помещен под общую эндотрахеальную анестезию.

Торакальные и абдоминальные процедуры После выполнения резекции поврежденного сегмента дыхательных путей во время операции интраоперационно засевают конструкцию дыхательных путей с биоптатами респираторных клеток на внутреннюю поверхность. Затем в трансплантат вводят (кондиционируют) факторы роста, включая 10 нг/мл рекомбинантного человеческого трансформирующего фактора роста-β 3, 10 нмоль/л рекомбинантного пептида, родственного паратиреоидному гормону, 100 нмоль/л дексаметазона и 10 мкг/мл инсулина. , GCSF (10 мкг/кг) и эритропоэтин (40 000 МЕ) (для стимуляции мобилизации периферических гемопоэтических клеток). Затем имплантат анастомозируют проксимально и дистально, чтобы восстановить дефект дыхательных путей с помощью швов. Затем его покрывают и заворачивают лоскутом большого сальника (жировая васкуляризированная ткань, отделяемая от большого изгиба желудка, собираемая на правой или левой желудочно-сальниковой артерии, а затем переносится в средостение трансдиафрагмально или субстернально), чтобы гарантируют долгосрочную защиту трансплантата и анастомоза и обеспечивают непрямую неоваскуляризацию трансплантата.

После трансплантации:

Послеоперационное лечение

Для стимуляции регенеративных процессов пациенту (текущий вес около 13 кг) в послеоперационном периоде будет назначено медикаментозное лечение путем системных инъекций:

1. Аналогичные рекомбинанты GCSF (граноцит, 10 млн МЕ/кг, максимум до 30 млн МЕ)
2. Синтетические аналоги Эритропоэтина (Эпоэтин альфа или бета 40 000 МЕ)

Оба фактора будут вводиться в подходящих концентрациях для стимуляции мобилизации/рекрутирования гемопоэтических клеток в "регенеративных" дозах, не связанных с какими-либо побочными эффектами. Каждый второй день будет контролироваться уровень эритропоэтина в плазме и анализ крови (включая гемоглобин и количество лейкоцитов). Уровни гемоглобина выше 15 г/дл вызовут опасения по поводу повышенной вязкости и быстрого удаления 10-20 см3/кг крови и могут потребовать добавления непрерывной инфузии гепарина для поддержания уровней активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) между 40-60 секунд. Уровни лейкоцитов выше 50-60 000/мкл будут считаться «токсичными» и приведут к сокращению/приостановке терапии GCSF до тех пор, пока число не упадет ниже 30 000. Лечение GCSF и эритропоэтином будет проводиться через день в течение 2 недель после трансплантации в соответствии со следующей таблицей:

Следовать за

Последующее наблюдение будет проводиться в отделении кардиоторакальной хирургии Краснодарской краевой больницы и будет включать:

1. Эндоскопическая оценка (гибкая и/или жесткая бронхоскопия) пересаженных дыхательных путей ежедневно в течение первой недели и через день в течение второй недели, после чего один раз в месяц в течение первых шести месяцев, а затем каждые 6 месяцев в течение первых 5 лет. .
2. Оценка анализа крови по формуле лейкоцитов ежедневно в течение первых двух недель.
3. Оценка мобилизованных прогениторных клеток из периферической крови через день в течение 2 недель.
4. Иммуногенная оценка. Через 3, 7 и 30 дней после трансплантации будет взят образец крови для исследования гистосовместимости путем оценки антител. Иммуногенное наблюдение также будет проводиться через 3, 6 и 12 месяцев после трансплантации.
5. Послеоперационные ингаляции тобрамицина (2x5 мл/день в течение 30 дней) для профилактики пневмонии и бактериального заражения трансплантата.
6. Компьютерная томография шеи и грудной клетки с трехмерной реконструкцией пересаженных дыхательных путей будет проводиться через 1, 3 и 6 месяцев наблюдения, а затем каждые 6 месяцев в течение первых 5 лет.