Trasplante clínico de ingeniería de tejido laringotraqueal

Antes del trasplante los pacientes tendrán las evaluaciones de laboratorio e instrumentales.

Tres días antes del trasplante se le realizará al paciente una aspiración de médula ósea. Las células mononucleares de la médula ósea (MNC) se aislarán de los glóbulos rojos (RBC) en el sistema automático totalmente cerrado aprobado por la FDA (Sepax, BioSafe America, Inc.). El producto final, resuspendido con medio de cultivo celular (DMEM+10% albúmina y 10% plasma autólogo) en un volumen de 200 mL, se colocará en una bolsa de transferencia de 600 mL. Se tomarán 2 ml del producto de la bolsa antes del uso clínico para probar la esterilidad utilizando medios de cultivo y citometría inmunofluorescente para caracterizar el tipo de célula y la viabilidad.

Dos días antes del trasplante, el paciente comenzará una terapia de "refuerzo" para movilizar las células mediante inyecciones sistémicas de recombinantes análogos del factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF)(Granocyte, 1 M UI/kg (máx. 15 M UI) y Eritropoyetina, 400 UI/kg (máx. 6.000 UI). Estos se inyectarán durante los dos días previos a la cirugía.

InBreath Bioreactor (el biorreactor especial para cultivar la tráquea) El trabajo en el protocolo actual implicará un diseño de biorreactor utilizado anteriormente por las universidades Macchiarini P. ang en una primera implantación exitosa en el hombre de un reemplazo de vía aérea grande diseñado por tejido. El dispositivo, comercializado bajo el nombre InBreath 3D Organ Bioreactor (Harvard Bioscience, Inc.) está diseñado para colocarse dentro de una incubadora de cultivo de tejidos y consta de una cámara modular de polisulfona para órganos, una unidad motora y un control remoto. La cámara se puede desmontar fácilmente de la unidad del motor y su construcción de polisulfona permite la esterilización con el proceso estándar de esterilización con plasma de gas que está fácilmente disponible en el quirófano de Peoria. La unidad de motor proporciona una rotación constante al soporte de tejido dentro de la cámara, asegurando la aplicación controlada de fuerzas de corte hidrodinámicas a la construcción traqueal en desarrollo. Una carcasa de motor completamente cerrada protege el motor sin escobillas de la humedad corrosiva dentro de la incubadora. La unidad de control remoto se coloca fuera de la incubadora y proporciona un medio para ajustar la velocidad de rotación sin perturbar el entorno de la incubadora.

La construcción sembrada se dejó incubar en el biorreactor durante 96 horas antes de retirarla para la implantación. Sobre la base de los cinco casos anteriores de adultos que utilizaron andamios sintéticos POSS-PCU (silsesquioxano poli(carbonato-urea) oligomérico poliédrico), PET (tereftalato de polietileno) y PET:PU (poliuretano), las superficies internas y externas del andamio ser sembrado con la fracción de células mononucleares de médula ósea recién aislada. El biorreactor se pondrá en marcha con una velocidad inicial de 0,5 ciclos/min durante 18 horas (luego aumentará gradualmente hasta 2,5 ciclos/min). La incubación será durante las 48 horas previas al procedimiento de trasplante. Este protocolo de incubación funcionó muy bien en los casos anteriores utilizando los tres andamios traqueales de nanocompuestos sintéticos diferentes.

Pasos de cultivo:

El procedimiento de resiembra traqueal se realizará en nuestra instalación de cultivo aséptico GMP (buenas prácticas de fabricación) que se estableció y se encuentra en pleno funcionamiento.

1. Las MNC aisladas se prepararán según el protocolo Sepax 2 para la separación de la médula ósea y se resuspenderán en una bolsa de 300 ml que contenga solución salina normal al 0,9 % (con albúmina humana al 10 %).
2. El andamio esterilizado (esterilización por irradiación gamma), el biorreactor (esterilización por plasma) y los instrumentos quirúrgicos (esterilizados en autoclave) se colocarán en la campana laminar.
3. Todas las personas que manipulen las células/biorreactor y el andamio estarán completamente capacitados para cumplir con los estándares de grado GMP, a saber, guantes estériles, overoles específicos, etc.
4. El biorreactor se abrirá dentro de la campana en condiciones estériles y se colocará sobre un tejido estéril. El andamio se montará en los accesorios de sujeción de órganos y se colocará en el biorreactor. Una vez que el andamio se transfiere y se fija en el biorreactor, el MNC (+DMEM más albúmina y plasma autólogo) se sembrará en la superficie del andamio. El medio (que incluye plasma autólogo y albúmina humana) se agregará a la cámara del biorreactor hasta un volumen total de 200 ml.
5. Los factores se sumarán al medio: 39,3 ng/mL (100 nmol/L) dexametasona y 10 μg/mL de insulina.
6. Luego, la cámara del biorreactor (incluido el andamio, MNC + 200 ml de medio) se colocará en la incubadora y se montará en la unidad motora del biorreactor (previamente colocada dentro de la incubadora).
7. El biorreactor se pondrá en marcha con una velocidad inicial de 0,5 ciclos/min durante 18 h (luego aumentará gradualmente hasta 2,5 ciclos/min).
8. Después de 24 h, se agregarán 50 ml adicionales del medio mencionado anteriormente para un volumen total de 250 ml dentro de la cámara. En este momento, se analizará una pequeña alícuota del líquido de la cámara con tinción de Gram y se inyectará en medios de cultivo para comprobar si hay contaminación.
9. Después de 48 horas, se abrirá la cámara y se recolectará una alícuota para cultivo y tinción de Gram. Se tomará una pequeña biopsia de la neotráquea para la prueba de viabilidad de MTT. Una vez que se determina que las células son viables y no hay signos de contaminación de los medios (tinción de Gram y lectura intermedia del cultivo de inoculación directa), se considerará que la tráquea está lista para la implantación y se colocará al paciente bajo anestesia y se procederá con el procedimiento quirúrgico. comenzó.

Día del trasplante:

Procedimiento quirúrgico intraoperatorio La mañana del trasplante se analizará el crecimiento celular del injerto (prueba MTT y esterilidad mediante tinción de Gram y análisis de los resultados del cultivo intermedio). Una vez que se considere que el injerto está listo para la implantación, se colocará al paciente bajo anestesia general endotraqueal.

Procedimientos torácicos y abdominales Una vez realizada la resección del segmento dañado de la vía aérea, la construcción de la vía aérea se sembrará intraoperatoriamente con las biopsias de células respiratorias en la superficie interna. Luego, se inyectará (acondicionará) el injerto con factores de crecimiento, incluidos 10 ng/mL de factor de crecimiento transformante humano recombinante-β 3, 10 nmol/L de péptido relacionado con la hormona paratiroidea recombinante, 100 nmol/L de dexametasona y 10 µg/mL de insulina. , GCSF (10 µg/kg) y Eritropoyetina (40.000 UI) (para estimular la movilización de las células hematopoyéticas periféricas). Luego, el implante se anastomosa proximal y distalmente para reconstruir el defecto de la vía aérea con suturas. Luego se cubrirá y envolverá con un colgajo de epiplón mayor (tejido adiposo vascularizado separado del gran pliegue del estómago, recolectado en la arteria gastroepiploica derecha o izquierda y luego transportado al mediastino transdiafragmáticamente o subesternalmente), para garantizar la protección a largo plazo del injerto y de la anastomosis y obtener la neovascularización indirecta del injerto.

Después del trasplante:

Tratamiento postoperatorio

Para potenciar el proceso regenerativo, el paciente (peso actual de unos 13 Kg) será tratado farmacológicamente en el postoperatorio mediante inyecciones sistémicas de:

1. Recombinantes análogos de GCSF (Granocyte, 10 millones de UI/kg hasta un máximo de 30 millones de UI)
2. Sintéticos análogos de eritropoyetina (Epoetina alfa o beta 40.000 UI)

Ambos factores se administrarán en concentraciones adecuadas para estimular la movilización/reclutamiento de células hematopoyéticas, en dosis "regenerativas" que no se han asociado con efectos secundarios. Cada dos días se controlará el nivel de eritropoyetina en plasma y el hemograma (incluidos los recuentos de hemoglobina y glóbulos blancos). Los niveles de hemoglobina superiores a 15 g/dl generarán preocupación por la hiperviscosidad y la pronta extracción de 10-20 cc/kg de sangre y pueden incitar a agregar una infusión continua de heparina para mantener los niveles de tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) entre 40-60 segundos. Los niveles de glóbulos blancos por encima de 50-60 000/μl se considerarán "tóxicos" y darán como resultado una reducción/suspensión de la terapia con GCSF hasta que los números caigan por debajo de 30 000. El tratamiento con GCSF y Eritropoyetina se realizará en días alternos durante las 2 semanas siguientes al trasplante según la siguiente tabla:

Hacer un seguimiento

El seguimiento se llevará a cabo en el Departamento de Cirugía Cardiotorácica del Hospital Regional de Krasnodar e incluirá:

1. Evaluación endoscópica (broncoscopia flexible y/o rígida) de la vía aérea trasplantada todos los días durante la primera semana y cada dos días durante la segunda semana, después de lo cual una vez al mes durante los primeros seis meses, y cada 6 meses a partir de entonces durante los primeros 5 años .
2. Evaluación del hemograma con fórmula de glóbulos blancos diariamente durante las dos primeras semanas.
3. Evaluación de células progenitoras movilizadas de sangre periférica cada dos días durante 2 semanas.
4. Evaluación inmunogénica. A los 3, 7 y 30 días del trasplante se le tomará una muestra de sangre para hacer un estudio de histocompatibilidad evaluando los anticuerpos. El seguimiento inmunogénico también se realizará a los 3, 6 y 12 meses desde el trasplante.
5. Inhalación postoperatoria de Tobramicina (2x5ml/día durante 30 días) para prevenir neumonías y contaminación bacteriana del injerto.
6. Se realizará tomografía computarizada de cuello y tórax con reconstrucción tridimensional de la vía aérea trasplantada al mes 1, mes 3 y mes 6 de seguimiento, y posteriormente cada 6 meses durante los primeros 5 años.